Biological role of nitrite and nitric oxide in the stomach: from diet to protein tyrosine with implications for gastric physiology

Abstract

O óxido nítrico (•NO) é um radical livre com funções de sinalização celular reconhecidas nos sistemas cardiovascular, nervoso e imunitário. A sua síntese in vivo é altamente regulada, sendo levada a cabo pelas •NO sintases. Uma vez produzido, o •NO participa numa panóplia diversificada de reacções químicas com consequências importantes para a fisiologia celular. Apesar de não ser um radical livre particularmente reactivo, os seus efeitos biológicos devem-se em grande parte às suas propriedades físico-químicas, nomeadamente à sua capacidade de difusão através das membranas celulares. Desta forma, não existe complementaridade estrutural entre este radical e um receptor específico, sendo as suas acções devidas a interacções aleatórias com moléculas-alvo, nomeadamente a guanilato ciclase solúvel. A dinâmica entre a sua síntese e, posteriormente, a sua difusão e reacções com alvos biomoleculares – e aqui incluem-se não só as interacções bioquímicas com a guanilato ciclase mas outras com implicações funcionais, nomeadamente com a hemoglobina, citocromo c oxidase, aconitase ou outros radicais –determina os efeitos biológicos do •NO. Na sua esfera de difusão, e em função do estado redox do microambiente, o •NO pode ser oxidado a nitrito e, posteriormente, a nitrato. Este paradigma, corolado pela L-aginine-nitric oxide pathway, sofreu recentemente uma reviravolta dado que foi demonstrado que os produtos da oxidação do •NO, nitrato e nitrito, podiam ser reduzidos in vivo de forma a produzir •NO num processo independentemente das NOS. Esta outra via foi por isso designada nitrate-nitrite-nitric 2 oxide pathway. O nitrito presente na dieta (vegetais, carnes curadas e água) é incorporado na saliva e posteriormente transportado para o estômago. No lúmen gástrico, devido ao pH extremamente baixo, o nitrito é reduzido a •NO e outros óxidos de nitrogénio com funções sinalizadoras. Com esta mudança de paradigma, a dieta passou a ter um papel crucial na biologia do •NO. Os polifenóis, particularmente abundantes em alimentos da Dieta Mediterrânica, reduzem univalentemente o nitrito a •NO no ambiente acídico do estômago. Inicialmente, no trabalho apresentado nesta tese é estabelecida a prova de conceito de que a ingestão de alimentos com alto teor em polifenóis potencia a produção de •NO no estômago humano a partir do nitrito. Uma vez que o •NO derivado do nitrito desempenha funções gastroprotectoras, esta observação tem óbvias consequências para a fisiologia gastrointestinal. Tal como supracitado, o •NO é uma molécula altamente difusível e, como tal, a sua capacidade de difusão no estômago foi também abordada neste estudo. Foi observado que o •NO produzido no lúmen gástrico difunde para a mucosa e é, inclusivamente, detectado na camada serosa, num modelo ex vivo. Este resultado sugere que na ausência de uma circulação sanguínea funcional, o •NO difunde todas as camadas histológicas da parede do estômago. A mesma experiência realizada in vivo, em ratos anestesiados, demonstrou que é impossível detectar •NO na serosa, provavelmente devido à rápida reacção com a hemogblobina circulante. Em conjunto, estes resultados indicam que uma vez produzido no lúmen gástrico a partir do nitrito com origem na dieta, o •NO difunde até aos vasos sanguíneos da mucosa modulando o tónus vascular local. 3 Tal como já foi referido, o nitrito é reduzido a •NO no meio ácido do estômago, mas pode também originar outros óxidos de nitrogénio capazes de exercer funções de sinalização celular, nomeadamente através de modificações pós-tradução de proteinas. A nitração é uma modificação pós-tradução que se caracteriza pela ligação covalente de um grupo nitro à posição orto de um anel aromático, tipicamente de um resíduo de tirosina. Além de ser um processo selectivo, em algumas circunstâncias esta modificação bioquímica pode alterar a função da proteina, induzindo perda ou ganho de função. Neste sentido, a nitração de proteinas relevantes para a fisiologia gástrica, mediada pelo nitrito da dieta, foi também abordada neste trabalho. A pepsina é uma endopeptidase secretada na forma de zimogénio, pepsinogénio, pelas células principais da mucosa gástrica. Uma vez no lúmen, devido ao pH ácido, o pepsinogénio é activado a pepsina. Os dados experimentais aqui apresentados demonstram que a pepsina pode ser nitrada pelo nitrito a pH ácido. Acresce ainda referir que, como seria expectável devido à capacidade de difusão do •NO, a nitração do pepsinogénio foi também observada ao pH fisiológico da mucosa. Provavelmente, o mecanismo envolvido inclui reacções secundárias do •NO com outros radicais, culminando na formação de espécies nitrantes. O impacto da nitração na função proteolítica da pepsina foi também avaliado in vitro, observando-se uma dimunição de função para quatro substratos distintos. Por outro lado, in vivo, estes resultados são traduzidos na prevenção do desenvolvimento de úlceras secretagogas. Não obstante ser a protease mais abundante no estômago, a pepsina é responsável pela digestão de cerca de 15% das 4 proteinas da dieta. Tem, no entanto, um reconhecido papel no desenvolvimento de úlceras gástricas devido à sua capacidade de erodir a mucosa. Neste trabalho observou-se que a dimunição de função proteolítca da pepsina evita o desenvolvimento de úlceras gástricas provavelmente por inibição da digestão de proteinas da mucosa. Do ponto de vista mecanístico, ensaios realizados com urato, um sequestrador do •NO2, inibiram quer a nitração da pepsina, quer o efeito preventivo de úlceras, sugerindo que este radical é, pelo menos um dos agentes nitrantes derivados do nitrito. Além disso, usando um modelo de ratinhos germ-free, também é demonstrado que o •NO modula a ocorrência de reacções de nitratção na mucosa gástrica. O trabalho apresentado nesta tese acrescenta novos dados à complexa biologia do nitrito no contexto gástrico. É estabelecida a prova de conceito que a ingestão de alimentos ricos em polifenóis potencia a formação de •NO a partir do nitrito no estômago e que uma vez produzido, o •NO difunde induzindo relaxamento da musculatura lisa e provavelmente modulando directamente o fluxo sanguíneo da mucosa. Além disso, é introduzido um conceito inovador que envolve a modificação da função de proteínas gástricas através de modificações pós-tradução induzidas pelo eixo nitrito-•NO proveniente da dieta. Em particular, é demonstrado que o nitrito induz a nitração de proteinas gástricas com consequente dimunição de função, nomeadamente na prevenção da úlcera gástrica. Estas observações podem ter aplicações terapêuticas importantes uma vez que estes efeitos são modulados pela dieta. 5

Nitric oxide (•NO) is a ubiquitous signaling molecule that regulates several cell and tissue functions. Critical physiological mechanisms such as regulation of vascular tone, immune response and neuromodulation rely primarily on the dynamics of •NO synthesis by the family of NO synthases and the chemistry upon diffusion in the biological milieu. The biological fate of •NO depends on different conditions, including the availability of kinetic-favorable targets, from which reactions with functional outcomes result, and also on the redox microenvironment that may drive its oxidation to nitrite and nitrate. Until recently, nitrite has been considered either a stable metabolite of •NO metabolism or a noxious product that, in the stomach, could give rise to carcinogenic nitrosamines. This view is now rapidly changing and not only modulatory actions have been assigned to nitrite but it may represent the largest •NO reservoir in the body. Inorganic nitrite, derived from the reduction of nitrate in saliva, has recently emerged as a protagonist in •NO biology as it can be univalently reduced to this free radical, in the healthy human stomach. This reaction takes advantage of the high nitrite concentrations (achieved through the reduction of dietary nitrate by oral bacteria) and low pH. Despite the fact that several proteins (including enzymes) have been shown to reduce nitrite to •NO at low oxygen tensions, the highest yields of •NO in vivo are intragastric. Important physiological implications have been attributed to nitrite-derived •NO in the cardiovascular and gastrointestinal systems. In the 6 gastrointestinal tract, it has been shown to modulate host defense, blood flow, mucus formation and motility. Dietary polyphenols, due to their redox potential and high availability in unmodified forms in the stomach, may promote the reduction of nitrite. These compounds univalently reduce nitrite to •NO and simultaneously are oxidized to the respective semi-quinone radicals. Initially, in the work presented in this thesis it is established the proof of concept that the ingestion of foodstuffs rich in polyphenols enhance •NO production from nitrite in the human stomach. Furthermore, due to its chemical properties (small, hydrophobic molecule), •NO was shown to diffuse from its production site (gastric lumen) towards the mucosa. In ex vivo experiments •NO was detected electrochemically within the gastric serosal layer, demonstrating that in the absence of a functional blood flow, it diffuses the entire gastric wall. On the contrary, using an in vivo rat model, •NO was not detected, suggesting that circulating hemoglobin was acting as a sink for •NO. These results suggest that dietary nitrite-derived •NO is produced in the stomach lumen and diffuses towards the mucosal blood vessel, likely modulating gastric blood flow and, as it is also shown, to induce smooth muscle relaxation. Notwithstanding, at acidic pH, nitrite generates different nitrogen oxides depending on the local microenvironment, including •NO, •NO2, dinitrogen trioxide (N2O3), and peroxynitrite (ONOO-). Thus, the gastric environment is a significant source of nitrating and nitrosating agents. Therefore, in the second part of this work, the ability of dietary nitrite to nitrate specific gastric proteins was studied. Nitration, and in particular tyrosine nitration, is a post- 7 translational modification in which a nitro group is inserted in the ortho position of a tyrosine aromatic ring. Generally speaking, nitration may induce a gain or a loss of protein function. Following this rationale, intragastric protein nitration was tracked. Pepsin, the major gastric protease, and its zymogen, pepsinogen, were shown to be nitrated by nitrite in the rat stomach. Pepsinogen (at pH 7.4) and pepsin (at pH 2) nitration correlated with the improvement of both NSAIDs- and pentagastrin-induced ulcers. This observation is in accordance with data in vitro, showing that nitration decreases the proteolytic function of pepsin. In a scenario of peptic ulcers, the erosion of gastric mucosa by pepsin is inhibited when this protease is nitrated by dietary nitrite. Using a model of germ-free mice and a •NO2 scavenger (urate) it is shown that gut microbiota, •NO and •NO2 are key players in intragastric nitration reactions. The work presented herein establishes mechanistically, in humans, the reduction of dietary nitrite to •NO by polyphenols in the stomach with different functional implications. Firstly, suggests that hence formed •NO may induce local vasodilation and secondly adds a new concept to the field of nitrite biology by showing that dietary nitrite induces nitration of endogenous proteins with impact on the prognostics of gastric ulcers. From the biomedical viewpoint, this work contributes to open new therapeutic approaches whereby anti-ulcerogenic and smooth muscle relaxant compounds are dietary-driven but endogenously generated as a consequence of the rich nitrite:nitric oxide biochemistry at the acidic gastric pH.