Skeletal muscle atrophy: the role of miRNAs

Abstract

A atrofia do músculo esquelético é uma condição associada à perda de massa muscular que ocorre em várias doenças. Esta atrofia é uma resposta característica ao jejum, envelhecimento e a condições de desuso ( como imobilização, desenervação e falta de carga no músculo) mas também ocorre como complicação associada a diversas doenças crónicas como cancro, diabetes, sepsia, SIDA e falha renal e cardíaca entre outras. Independentemente da causa, a maior característica da atrofia muscular é um aumento da degradação proteica em relação à síntese proteica. A atrofia do músculo esquelético é um processo regulado a nível da transcrição transcrição (Lecker et al., 2004; Sandri et al., 2004a; Stitt et al., 2004). Os factores de transcrição da família FoxO são fundamentais para a regulação de enzimas limitantes que pertencem aos dois mecanismos catabólicos mais importantes do músculo: o sistema ubiquitina/proteassoma proteassoma (Gomes et al., 2001; Sandri et al., 2004a) e o sistema autofagia/lisossoma (Mammucari et al., 2007; Zhao et al., 2007). O factor de transcrição NF-kB também está envolvido na regulação que ocorre durante o processo de atrofia muscular (Cai et al., 2004; Hunter and Kandarian, 2004). Para além disso, um grupo restrito de genes, chamados “atrogenes” ou genes relacionados com a atrofia, encontram-se frequentemente sobre- ou sub-expressos em todas as condições de atrofia. Estas evidências sugerem que existem mecanismos moleculares partilhados que controlam a atrofia muscular. Entre os “atrogenes” encontram-se genes envolvidos em diversos processos biológicos fundamentais que podem requerer um nível adicional de ajustamento durante a perda de massa muscular. Este ajustamento pode ser conseguido através de uma nova classe de moléculas reguladoras chamadas miRNAs. Os miRNAs são hipoteticamente capazes de regular vários genes da mesma via de sinalização. O seu papel no músculo adulto é amplamente desconhecido. Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes com aproximadamente 22 nucleotídeos que regulam a expressão de genes. São altamente conservados entre espécies e é previsto que sejam capazes de regular a expressão de aproximadamente 60% dos genes codificantes. Convencionalmente, os miRNAs regulam a expressão génica ligando-se à região 3’-UTR (região não traduzida) dos RNAs mensageiros (mRNA), e posteriormente bloqueando a sua tradução ou induzindo a sua degradação. Cada miRNA tem o potencial de regular centenas mRNAs. Por seu lado, cada mRNA pode ser regulado por centenas de miRNAs diferentes, criando-se deste modo redes reguladoras complexas. Uma das principais características dos miRNAs é a sua especificidade. De facto, diversos miRNAs estão envolvidos em processos fisiológicos e ligados ao desenvolvimento, e requerem, por isso, uma expressão que é específica para determinado tecido e XVIII fase de desenvolvimento. Uma apertada regulação da expressão dos miRNAs é essencial e alterações na sua expressão estão associadas a situações patológicas. O papel essencial que estas moléculas reguladoras têm no músculo esquelético foi claramente demonstrado em diversos modelos animais nos quais a via dos miRNAS foi bloqueada, comprometendo o desenvolvimento miogénico. (Kwon et al., 2005; O'Rourke et al., 2007; Sokol and Ambros, 2005). Para além destas evidências, existe um grupo de miRNAs específicos do músculo – são chamados myomiRs. Este grupo é composto pelos miRNA-1, miRNA-133, miRNA-206, miRNA-208a, miRNA-208b e miRNA-499. Estes myomiRs estão envolvidos em diversos processos da fisiologia muscular, incluindo miogénese, estabelecimento do tipo de fibra e regeneração muscular. Na regulação destes processos estão envolvidos outros miRNAs para alem dos myomiRs. O envolvimento de diversos miRNAs na regulação de vários aspectos da biologia do músculo cria uma rede regulatória, aumentando deste modo a complexidade da biologia do músculo. Para além disso a desregulação da expressão de miRNAs está associada a doenças musculares (De, V et al., 2010; Eisenberg et al., 2007; McCarthy and Esser, 2007a; Williams et al., 2009; Yuasa et al., 2008a). Independentemente do aumento do numero de evidências relacionadas com a função dos miRNAS, poucos estudos abordaram o seu papel biológico in vivo. Nesta tese, nós estudamos o papel dos miRNAs no processo de atrofia do músculo esquelético. Foi utilizada uma aproximação in vivo, que se baseou em análises bioinformáticas, para identificar alguns dos mecanismos controlados pelos miRNAs. Na primeira parte desta tese, nós estabelecemos o perfil de expressão de miRNAs em diversas condições de atrofia, usando para isso análise de micro-arrays. De acordo com os nosso resultados, cada condição atrófica possui um perfil de expressão de miRNAs específico. Apenas condições atróficas a médio-longo termo apresentam uma significativa alteração nos níveis de expressão dos miRNAs. Apesar de não ter sido encontrado nenhum miRNA comum a todas as condições de atrofia, identificamos dois miRNAs, miRNA-206 e miRNA-21, fortemente aumentados após desenervação. Decidimos por isso estudar o seu papel biológico in vivo. Os nossos estudos demonstraram, pela primeira vez, que a sobre-expressão destes miRNAs induzem um fenótipo atrófico enquanto a inibição in vivo induz um fenótipo hipertrófico. Na segunda parte desta tese, estabelecemos o perfil de expressão de mRNAs das mesmas amostras que tinham sido usadas para estabelecer o perfil de expressão de miRNAs. Uma aproximação bioinformática baseada nos dados de expressão génica permitiu-nos identificar os genes que eram simultaneamente alvos previstos dos miRNAs e que se encontravam sub-expressos nos arrays de expressão de mRNA. Esta metodologia permitiu-nos identificar um grupo de genes alvo cuja expressão é regulada negativamente pelos miRNAS. Em particular, decidimos estudar XIX YY1, eIF4E3 e PDCD10 porque estes três genes são previsivelmente regulados pelos dois miRNAs. De facto, experiências de luciferase juntamente com experiências de sobre-expressão confirmaram que YY1 é um alvo do miRNA-21 e que eIF4E e PDCD10 são alvos do miRNA-206 e miRNA-21. Apesar do papel destes genes durante o processo de atrofia muscular não ser conhecido, sabemos que estão sub-expressos durante a desenervação. A relevância da diminuição na expressão de YY1, eIF4E3 e PDCD10 durante a desenervação está presentemente a ser investigada. Os nosso resultados indicam que o processo atrófico, para além da regulação a nível da transcrição, é também modulado por miRNAs. Para além disso os nossos dados apontam para o miRNA-206 e miRNA-21 como importantes moduladores do processo atrófico, sugerindo que estes miRNAs podem ser potenciais alvos terapêuticos.

Skeletal muscle atrophy is a condition associated to loss of muscle mass in many diseases. Atrophy is a characteristic response to starvation, aging and disuse conditions (such as immobilization, denervation or unloading) but it also occurs as a complication in several chronic diseases such as cancer, diabetes, sepsis, AIDS, renal and heart failure and others. Independently of the cause, the main feature of muscle wasting is the enhancement of protein degradation that overcomes protein synthesis. Skeletal muscle atrophy is a transcriptionally regulated process (Lecker et al., 2004; Sandri et al., 2004a; Stitt et al., 2004). FoxOs are critical transcription factors involved in the regulation of critical rate-limiting enzymes belonging to the two most important degradative pathways: the ubiquititn/proteasome (Gomes et al., 2001; Sandri et al., 2004a) and the autophagy/lysosome (Mammucari et al., 2007; Zhao et al., 2007). Also NF-kB is involved in transcriptional regulation during muscle wasting (Cai et al., 2004; Hunter and Kandarian, 2004). Furthermore, a restricted group of genes, called atrophy-related genes or atrogenes, are commonly up- or down-regulated to all the atrophic conditions (Lecker et al., 2004). These findings suggest the presence of a shared molecular mechanism that controls muscle atrophy. Among the atrogenes there are genes involved in several fundamental biological processes that may require an additional regulation to fine-tune their action during muscle wasting. This action might be accomplished by a new class of regulatory molecules, the miRNAs. miRNAs are predicted to regulate several genes from the same pathway. Their role in adult skeletal muscle is largely unknown. miRNAs are small non-coding RNAs with approximately 22 nucleotides that regulate post-transcriptionally gene expression. They are highly conserved among species and they are predicted to regulate the expression of approximately 60% of protein coding genes. Conventionally, miRNAs are known to regulate gene expression by binding to the 3’-Untranslated Regions (3’UTRs) of the mRNAs and, therefore, blocking translation or inducing mRNA degradation. Each miRNA has the potential to target hundreds of different mRNAs. On the other hand each mRNA can be targeted by different miRNAs creating in this way complex regulatory networks. One of the hallmarks of miRNAs is their specificity. In fact, several miRNAs are involved in developmental and physiological processes that require tissue- and stage-specific expression. The tight regulation of miRNAs expression is crucial and alterations are correlated with pathological conditions. The essential role of these regulators in skeletal muscle was clearly demonstrated in several animal models in which the miRNA pathway was blocked leading to a compromised myogenic XVI development (Kwon et al., 2005; O'Rourke et al., 2007; Sokol and Ambros, 2005). Furthermore, several miRNA show a muscle-specific expression and are called myomiRs. This group is composed by miRNA-1, miRNA-133, miRNA-206, miRNA-208a, miRNA-208b and miRNA-499. Muscle specific miRNAs are involved in several processes of the muscle physiology including myogenesis, fiber type establishment and muscle regeneration. Besides myomiRs, other miRNAs were shown to be involved in the regulation of these processes. The involvement of several miRNAs in the regulation of several aspect of muscle biology creates a complex regulatory network increasing the complexity of muscle biology. Moreover miRNA deregulation is associated with muscle disease (De, V et al., 2010; Eisenberg et al., 2007; McCarthy and Esser, 2007a; Williams et al., 2009; Yuasa et al., 2008a). However, regardless of the growing evidences on miRNAs function few studies have addressed their biological role in vivo. In this thesis, we studied the role that miRNAs play in skeletal muscle atrophy. We have used an in vivo approach supported by bioinformatic analyses to identify some of the mechanisms controlled by miRNAs. In the first part of the thesis we have established the miRNA expression signature of several atrophic conditions by microarray analysis. According to our results, each atrophic condition has a specific miRNA expression profile. Only middle-to-late atrophic conditions showed a significant alteration of the miRNAs expression levels. Although no common miRNA was found between the different conditions, two highly up-regulated miRNAs were found in denervation, miRNA-206 and miRNA-21. Thus, we decided to address their biological role in vivo. Our studies showed, for the first time, that in vivo over-expression of these two miRNAs leads to an atrophic phenotype, while inhibition of these miRNAs induced hypertrophy. In the second part of this thesis, we performed mRNA expression profile by using the same samples used for miRNA profile. A bioinformatic approach based on gene expression data allowed us to identify genes that were both predicted targets of the miRNAs and down-regulated in the mRNA expression arrays. This approach allowed the identification of a set of target genes that were directly down regulated by the miRNAs. In particular, we decided to study YY1, eIF4E3 and PDCD10 because they were predicted targets of both miRNAs. Indeed, luciferase experiments together with over-expression experiments confirmed that YY1 is a target gene of miRNA-21 and eIF4E3 and PDCD10 are targets of both miRNA-206 and miRNA-21. Although the role of these genes during skeletal muscle atrophy is still not clear, they are clearly down-regulated during denervation and the function of this down-regulation is currently under study. Our results indicate that the atrophic process, apart from the transcriptional regulation, is also under a miRNA fine tuning. Furthermore, our data point to miRNA-206 and miRNA-21 as important modulators of the atrophic process suggesting that they are potential therapeutic targets.