Preparação e caracterização de sistemas de libertação controlada de fármacos com base em polímeros de origem natural

Abstract

The main purpose of this work is the preparation and development of several controlled drug delivery systems built with natural polymers and suitable for different applications, like for colon-specific drug delivery or for the localized and prolonged delivery of drugs. With this objective, three potential controlled drug delivery systems, based on natural polymers, were prepared and characterized. In the first investigated system, the natural occurring polyester poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV, was processed in microparticles loaded with the hydrophobic drug flurbiprofen, by means of an oil-in-water emulsion/extraction solvent evaporation method, using chloroform as the organic phase and polyvinyl alcohol (PVA) as the emulsion stabilizer. A central composite experimental design was employed to evaluate the effect of two process variables – the polymer concentration in the organic phase and the surfactant concentration in the aqueous phase - on some of the final microparticles properties, specifically the encapsulation efficiency of the drug, the mean particle size, the width of the particles size distribution, and the required time for the in vitro release of 50% of the encapsulated drug (t50%). The statistical analysis of the implemented experimental design revealed that the two investigated variables had a significant and opposite effect on the encapsulation efficiency of the drug. Also, it was found that the microparticles mean particle size increased with increasing concentrations of PHBV in organic phase and that the concentration of the surfactant in the aqueous phase played a critical role in the aggregation degree of the microparticles. It was concluded that a minimum PVA concentration was required to stabilize the oil-in-water emulsion and, in this way, obtain non-aggregated particles. The in vitro flurbiprofen release profiles from PHBV microparticles were very similar for all the prepared formulations, showing that more than 90% of the drug was released in the first eight hours of the essay. The time for the in vitro release of 50% of the encapsulated drug, t50%, was not significantly influenced by any of the two investigated variables. The comparison between the release profiles of flurbiprofen from the PHBV microparticles and the dissolution profile of the pure drug lead to the conclusion that the drug was essentially dispersed at the surface of the microparticles, rather than effectively entrapped in the polymeric matrix. Although the investigated formulations didn’t led to an effective immobilization of the flurbiprofen in the PHBV microparticles, this objective can be achieve with further investigation, namely by the manipulation of the drug/polymer mass ratio used in the microparticles preparation, among other variables. With the flurbiprofen effectively immobilized in the microparticles, it will be possible to then optimize the drug release profile in order to obtain a controlled and prolonged release of the immobilized flurbiprofen, suitable for the use of the microparticles as localized and prolonged drug delivery systems. In the second investigated system, the polysaccharide pectin was chemically modified by introducing, in its structure, vinylic or methacrylic terminal functional groups. The functionalized pectin derivatives, alone or together with the macromer poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), were transformed in chemical hydrogels by UV-induced free radical reticulation. In vitro drug release studies were used to evaluate the behavior of the produced hydrogels as controlled drug delivery systems. For this purpose, two low molecular weight hydrophilic drugs (gentamicin sulphate and sodium flurbiprofen), and two model proteins (bovine serum albumin (BSA) and lysosyme), were incorporate in the hydrogels during their formation and subsequently released in vitro. It was concluded that the extension of the chemical modification of pectin, which was carried out in a heterogeneous environment, was limited/controlled by the accessibility of the OH groups of the polysaccharide, which, in turn, was directly controlled by the swelling degree of the polysaccharide particles in the reaction solvent. The two low molecular weight hydrophilic drugs were rapidly liberated from the hydrogels. The release profiles revealed that, in approximately four hours, the entire incorporated drug was released. On the other hand, the in vitro release studies of the model proteins revealed an incomplete release of the incorporated proteins, probably because a fraction of protein was physical adsorbed in to polymeric matrix and/or covalently bounded to it. The presence of pectinolytic enzymes in the release medium result in a higher fraction of BSA released from the hydrogels, supposedly due to the enzymatic degradation of the tridimensional network structure of the polymer matrix. The results obtained with this work show that the produced hydrogels are suitable to be use as colon-specific drug delivery systems, especially of proteins. In the third and last investigated system, sponges of pectin and chitosan, prepared by the freeze-drying of the insoluble polyelectrolyte complexes (PECs) formed between the two polysaccharides, were produced and characterized. Three pectin/chitosan PECs sponges were prepared, using different initial proportions of the two polysaccharides. The three sponges, independently of the used proportions, had very similar compositions, being composed mainly from pectin (74 to 78%, mass percentage). The sponges were submersed in aqueous solutions, either at pH 2 or pH 7.4, and the weight loss was record during six weeks. The results revealed a continuous weight loss, attributed to the gradual liberation of polymers chains, as a consequence of the progressive loss of the ionic interactions established, during PECs formation, between the COO- groups of pectin and the NH3+ groups of chitosan. The composition analysis of the sponges during dissolution time, and their FTIR spectra, revealed that, at pH 2, the weight loss of the sponges was caused, equally, by the loss of pectin and chitosan. On the other hand, it was concluded that, at pH 7.4, the weight loss of the sponges was mainly due to the loss of pectin. A preliminary evaluation of the sponges as controlled drug delivery systems was made, by the incorporation of BSA in the sponges followed by the in vitro release, at pH 2 and pH 7.4. The in vitro release profiles obtained suggest that the released of the protein from the sponges is controlled by the strong interactions established between the protein molecules and the polymeric matrix. This preliminary study indicates that the produced PECs matrixes can be use to immobilized proteins and built colon-specific delivery systems of this type of biomacromolecules. In the three works presented in this Thesis it was possible to obtained significant conclusions that can be used in the future as basis for the continuation of the development of the different controlled drug delivery systems proposed in this work.

Este trabalho tem como principal objectivo a preparação de sistemas de libertação controlada com base em polímeros de origem natural e com o potencial de serem utilizados em diversas aplicações como a entrega específica de fármacos no cólon ou a libertação prolongada e localizada de fármacos. Para isto desenvolveram-se e caracterizaram-se três potenciais sistemas de libertação controlada de moléculas bioactivas, preparados com diferentes polímeros de origem natural. O primeiro sistema estudado envolveu a utilização do poliéster de origem natural poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato), PHBV, o qual foi investigado enquanto matriz para a imobilização do antiflamatório não esteróide flurbiprofeno em micropartículas preparadas pelo método da extracção/evaporação do solvente numa emulsão óleo/água, utilizando o clorofórmio como fase orgânica e o álcool polivinílico (PVA) como surfactante. Um desenho composto central de experiências foi implementado de forma a investigar o efeito de duas variáveis envolvidas no processo de preparação das micropartículas – a concentração do polímero na fase orgânica e a concentração do surfactante na fase aquosa - sobre algumas das propriedades finais dessas mesmas micropartículas, nomeadamente a eficiência de encapsulação do fármaco, o tamanho médio e a distribuição de tamanhos das micropartículas, e o tempo correspondente à libertação in vitro de 50% do fármaco encapsulado. Concluiu-se que as duas variáveis investigadas afectavam, significativamente e de forma oposta, a eficiência de encapsulação do fármaco. Igualmente, verificou-se que o tamanho médio das partículas era afectado positivamente pelo aumento da concentração do polímero na fase orgânica. A concentração do surfactante revelou ser um factor crítico no grau de agregação das micropartículas obtidas, tendo-se concluído que existe um limite mínimo requerido de concentração de surfactante para estabilizar a emulsão óleo/água e, consequentemente, obter micropartículas não agregadas. Os perfis de libertação in vitro do fármaco, a partir de micropartículas produzidas em diferentes condições experimentais, revelaram que mais de 90% do fármaco era libertado nas primeiras oito horas de ensaio. A análise estatística dos valores de t50% (tempo correspondente à libertação in vitro de 50% do fármaco encapsulado) revelou que nenhuma das duas variáveis experimentais investigadas influenciava significativamente este parâmetro. A comparação dos perfis de libertação in vitro do fármaco a partir de micropartículas e o perfil de dissolução do fármaco puro conduziu à conclusão de que o fármaco se encontra essencialmente disperso à superfície das micropartículas e não, como seria desejável num sistema de libertação controlada, efectivamente aprisionado na matriz polimérica. Embora, com as formulações investigadas, não se tenha obtido um sistema de libertação do furbiprofeno com a capacidade de libertar este de forma controlada ao longo de um período de tempo significativo (de semanas ou meses), a investigação e optimização de outras variáveis experimentais, nomeadamente a razão mássica fármaco/polímero utilizada na produção das micropartículas, poderá conduzir a um sistema de libertação capaz de libertar o flurbiprofeno da forma referida anteriormente, e que poderá ser utilizado na libertação controlada e localizada deste. No segundo sistema investigado o polissacarídeo pectina foi quimicamente modificado através da introdução na sua estrutura de grupos terminais vinílicos ou metacrílicos. Os derivados de pectina assim obtidos, por si só ou em conjunto com o macrómero poli(etileno glicol) diacrilato (PEGDA), foram utilizados na formação de hidrogéis químicos preparados por fotoreticulação. A actuação destes hidrogéis enquanto sistemas de libertação controlada foi investigada através de estudos de libertação in vitro de dois fármacos hidrofílicos de baixo peso molecular (sulfato de gentamicina e flurbiprofeno sódico) e de duas proteínas modelo (albumina de soro bovino (BSA) e lisozima). Todos os compostos bioactivo acima referidos foram imobilizados no hidrogel durante a sua formação. Relativamente à modificação química da pectina, a qual se processou em meio heterogéneo, conclui-se que a extensão da modificação química era limitada/controlada pela acessibilidade dos grupos hidroxilo do polissacarídeo, encontrando-se essa acessibilidade directamente relacionada com a capacidade de inchaço das partículas do polissacarídeo no solvente reaccional. No caso dos fármacos hidrofílicos de baixo peso molecular imobilizados nos hidrogéis preparados, verificou-se que estes se libertavam rapidamente, sendo a libertação total atingida, no máximo, passado quatro horas de ensaio. A libertação das proteínas modelo, a partir dos hidrogéis, revelou-se incompleta devido, provavelmente, à ligação covalente e/ou adsorção física de uma fracção da proteína à matriz polimérica. Constatou-se ainda que a presença de enzimas pectinolíticas no meio de libertação conduzia a uma maior quantidade de BSA libertada, supostamente devido à degradação por via enzimática da estrutura tridimensional do hidrogel. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os hidrogéis produzidos poderão ser utilizados enquanto sistemas de libertação específica no cólon, em particular na libertação de protéinas. Por fim, o terceiro sistema estudado envolveu a preparação e caracterização de esponjas de pectina e quitosano, as quais foram obtidas a partir da liofilização dos complexos polielectrolíticos (PECs) formados, em meio aquoso, entre os dois polissacarídeos. Foram produzidas três esponjas de PECs de pectina/quitosano utilizando diferentes proporções iniciais dos dois polissacarídeos. Independentemente das proporções utilizadas, os resultados da análise elemental revelaram que a composição das três esponjas era muito semelhante, sendo estas constituídas maioritariamente por pectina (entre 74 e 78%, percentagem mássica). Estudos da variação do peso das esponjas, realizados ao longo de seis semanas, revelaram que as esponjas perdiam massa de forma contínua, quando mergulhadas em soluções aquosas a pH 2 ou pH 7.4. Esta perda de massa foi atribuída à libertação gradual das cadeias dos dois polissacarídeos, causada pela quebra progressiva das ligações iónicas estabelecidas durante a formação dos PECs entre os grupos COO- da pectina e os grupos NH3+ do quitosano. A análise da composição das esponjas ao longo do tempo de dissolução, e o registo dos espectros de FTIR, revelou que, nas esponjas mergulhadas a pH 2, a perda de massa resultava tanto da perda de pectina como de quitosano, enquanto, a pH 7.4, a perda de massa podia ser maioritariamente atribuída à dissolução das cadeias de pectina. Este comportamento distinto pode ser atribuído aos diferentes estados de ionização/protonação dos dois polissacarídeos nos dois meios aquosos. Uma avaliação preliminar destas esponjas, enquanto sistemas de libertação controlada de proteínas, foi feita, através de um estudo de libertação in vitro de libertação da proteína BSA. Os resultados sugerem que a libertação de proteínas a partir deste tipo de material será controlada pelas fortes interacções físicas estabelecidas entre as proteínas e a matriz polimérica. Este resultado sugere que as matrizes de PECs desenvolvidas apresentam o potencial para serem utilizadas na preparação de sistemas de libertação específica de protéinas no cólon. Em cada um dos três trabalhos desenvolvidos e apresentados nesta Tese foi possível obter conclusões significativas, que poderão ser utilizadas como bases sólidas para a continuação do trabalho de desenvolvimento dos diferentes sistemas de libertação propostos.