Gene Editing Nanoformulations for Brain Applications

Abstract

In response to the increasing global aging population and the associated surge in age-related brain diseases, this work explores innovative approaches to overcome the blood-brain barrier (BBB) and address the neuronal loss in age-related pathologies, such as neurodegenerative disorders and stroke. The first part of this PhD thesis focused on the challenge of drug delivery to the brain. Recognizing the restrictive permeability of the BBB and its dynamic nature during aging, we investigated the use of plasma-derived small extracellular vesicles (sEVs) enriched with microRNAs (miRNAs) that are overexpressed during aging or age-related diseases. Intriguingly, our results demonstrated that miR-383-3p-enriched sEVs could transiently and reversibly increase the human BBB model paracellular permeability by downregulating claudin 5, a critical tight junction protein expressed in brain endothelial cells. This effect is mediated in part by the knockdown of activating transcription factor 4 (ATF4), a known target gene of miR-383-3p. We also developed a BBB model based on microfluidics in order to test the nanoformulation in a more physiological-like setting, obtaining results similar to the ones observed in the static model. This engineered sEVs-involving strategy holds promise for facilitating temporary BBB opening, enhancing the accessibility of therapeutic agents to the brain.The second part of this PhD thesis focused on the delivery of the CRISPR gene editing tool into brain cells, particularly astrocytes, for their direct reprogramming into neurons to address the neuronal loss in age-related pathologies. We initially developed an innovative polymeric drug delivery system to induce the gene knockout both in HeLa cells and in murine astrocytes with the Cas9-based system. Then, by using the developed nanoparticles (NPs) loaded with CRISPR/dCas9 ribonucleoprotein (RNP) and targeting the neurogenin 2 (Ngn2) gene, we induced the transdifferentiation of astrocytes into neurons, with multiple administrations. The synthesis of branched polymers enhanced the loading capacity of the NPs, showing the potential of non-viral delivery systems for dCas9-VPR delivery, crucial for the safe and effective modulation of brain cells.Through these dual endeavors, our goal was to contribute to the fields of neuroregeneration and drug delivery to the brain, with broader implications for addressing the healthcare challenges associated with an aging population.

Em resposta ao crescente envelhecimento da população global e ao aumento associado de doenças cerebrais, este trabalho explora estratégias inovadoras para cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) e combater a perda neuronal em patologias relacionadas com a idade, como distúrbios neurodegenerativos e acidente vascular cerebral.A primeira parte desta tese de doutoramento centrou-se no desafio da entrega de medicamentos no cérebro. Reconhecendo a permeabilidade restritiva da BBB e sua natureza dinâmica durante o envelhecimento, investigamos o uso de pequenas vesículas extracelulares (sEVs) do plasma enriquecidas com microRNAs (miRNAs) que são mais expressos durante o envelhecimento ou as doenças relacionadas à idade. Curiosamente, nossos resultados demonstraram que as sEVs enriquecidas com miR-383-3p aumentam transitoriamente e reversivelmente a permeabilidade paracelular do modelo de BBB humana, regulando negativamente a claudina 5, uma proteína crítica das junções entre as células endoteliais cerebrais. Este efeito é mediado em parte pelo knockdown do activating transcription factor 4 (ATF4), um conhecido gene alvo de miR-383-3p. Também desenvolvemos um modelo dinâmico da BBB baseado em microfluídica para testar a nanoformulação num ambiente mais biomimetico fisiologicamente, obtendo resultados semelhantes aos observados no modelo estático. Esta estratégia desenvolvida envolvendo sEVs é promissora para facilitar a abertura temporária da BBB, melhorando a acessibilidade de agentes terapêuticos ao cérebro.A segunda parte desta tese de doutoramento centrou-se na entrega do sistema de edição genética CRISPR em células cerebrais, particularmente em astrócitos, para a reprogramação direta destas células em neurónios para travar a perda neuronal em patologias relacionadas com a idade. Inicialmente, desenvolvemos um inovador sistema polimérico para a entrega do sistema da edição genética para induzir o knockout de genes tanto em células HeLa como em astrócitos de murganho com o sistema baseado na proteína Cas9. Depois, utilizando as nanopartículas (NPs) desenvolvidas carregadas com a ribonucleoproteína (RNP) CRISPR/dCas9 e fazendo a ativação do gene neurogenin 2 (Ngn2), induzimos a transdiferenciação de astrócitos em neurónios, com múltiplas administrações. A síntese de polímeros ramificados melhorou a capacidade de carga das NPs, mostrando o potencial dos sistemas de entrega não virais carregados com dCas9-VPR, crucial para uma modulação segura e eficaz das células cerebrais.Através destes dois estudos, o nosso objetivo foi contribuir para os campos da neuro-regeneração e da administração de medicamentos ao cérebro, com implicações mais amplas para enfrentar os desafios de saúde associados ao envelhecimento da população.