Mitochondrial Function and Immunometabolism - insights from murine and human studies

Abstract

INTRODUCTION: Low-grade inflammation and alterations of mitochondrial function are interconnected mechanisms that are related to chronic diseases, including obesity and type 2 diabetes. Adipose tissue (AT) is an immunometabolic tissue involved in the development of insulin resistance (IR), and T cells, which infiltrate it, play an important role in this process. Therefore, we aim to understand whether changes in oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity and changes in the number and phenotype of CD20⁺ T cells in AT might be potential indicators of metabolic disease progression.METHODS: Mitochondrial respiration in the AT of diabetic mice, and of humans with obesity at distinct metabolic profiles, was evaluated by high-resolution respirometry. In mice, the expression of mitochondrial proteins (OXPHOS complexes and uncoupling protein-1, UCP-1) was evaluated in AT by western blot, and malondialdehyde production and antioxidant capacity were evaluated by high-performance liquid chromatography and spectrophotometry. The identification, as well as the phenotypic and functional characterization of CD20⁺ T cells in peripheral blood (PB) (from humans without and with obesity, at distinct metabolic profiles) and in AT (humans with obesity), were performed using twelve-color flow cytometry.RESULTS: In diabetic mice, we found changes in OXPHOS capacity of AT due to already established diabetes. A high expression of UCP-1 and mitochondrial complexes (CIII, CIV) was observed in thoracic perivascular AT (tPVAT) compared to inguinal AT (iWAT), regardless of diabetes. Oxidative stress markers were decreased in tPVAT compared to iWAT, while OXPHOS capacity was higher in tPVAT. Fatty acid oxidation (FAO)-linked OXPHOS capacity was elevated in diabetic mice even with UCP-1 inhibition, compared to non-diabetic mice. In humans with obesity, we found changes in the OXPHOS capacity of AT throughout the progression of metabolic disease. The OXPHOS capacity was greater in omental adipose tissue (OAT) than in subcutaneous adipose tissue (SAT). We observed reduced biochemical coupling efficiency in AT, explicitly in SAT, in subjects with obesity IR normoglycemic (OB-IR-NG) and subjects with diabetes (OB-IR-T2D), due to pathological dyscoupling. However, the coupling efficiency linked to FAO was higher in OB-IR-NG in SAT and OAT. Bariatric surgery enhanced mitochondrial respiration in OAT, even without OXPHOS coupling efficiency.In humans without obesity (nOB), PB CD20⁺ T cells present a memory phenotype, and have a higher level of activation and high susceptibility to be immunoregulated by the PD-1/PD-L1 axis, compared to CD20⁻ T cells from the same individuals. Besides, a significant percentage of CD20⁺ T cells possess the ability to simultaneously produce the proinflammatory cytokines TNF-⍺, IFN-γ and IL-17. In humans with obesity, OAT presented a higher percentage of CD20⁺ T cells than PB and SAT. Compared to PB, CD20⁺ T cells in OAT were more polarized towards T1-like and a high percentage of IFN-γ⁺CD4⁺CD20⁺ T cells was found. Interestingly, OB-IR-NG presented a lower percentage and absolute number of circulating CD8⁺CD20⁺ T cells compared to nOB, and a higher percentage of PD-1⁺CD20⁺Tc1 cells in PB compared to subjects with obesity insulin sensitive (OB-IS). Regarding activation, OB-IR-T2D presented less activated circulating CD4⁺CD20⁺ T cells than OB-IS. Similarly, the percentage of activated CD20⁺ Tc1/17 cells in OAT was lower in OB-IR-T2D compared to OB-IS and subjects with prediabetes (OB-IR-PD). Furthermore, OAT from OB-IR-T2D showed a lower percentage of activated CD20⁺ Tfh cells compared to OB-IS and OB-IR-NG. In fact, the percentage of activated CD20⁺ Tfh cells in OAT was inversely correlated with HbA1c levels. After bariatric surgery an increase in the proportion of CD4⁺CD20⁺ T cells was found in PB, with a reduction in Th1 polarization, but at the expense of an increase in Th17. In OAT, the predominance of CD20⁺ Th1 cells was maintained after surgery, but an increase in Th1/17 and Tc1/17 was observed.CONCLUSION: This study is one of the first of its kind, in that it tries to understand the potential underlying mechanisms of obesity-related insulin resistance in OAT, pre and post bariatric surgery. Specifically, we made detailed analysis of the OXPHOS capacity and the role of CD20⁺ T cells in the AT immune infiltrate, of subjects with obesity, at distinct stages of dysmetabolism. OB-IR-T2D had the lowest OXPHOS capacity and the least percentage of activated CD20⁺ T cells in OAT. The OAT of the OB-IR-NG and OB-IR-PD groups presented a certain capacity for immunometabolic adaptation. The assessment of oxidative capacity and the count and phenotypic characterization of CD20⁺ T cells in fresh tissues could be useful tools for the early diagnosis of metabolic disease.

INTRODUÇÃO: A inflamação de baixo grau e a alteração da função mitocondrial são mecanismos interligados e estão relacionados com doenças crónicas, incluindo obesidade e diabetes tipo 2. O tecido adiposo (AT) é um tecido imunometabólico envolvido no desenvolvimento de resistência à insulina (IR), e as células T, que o infiltram, desempenham um importante papel neste processo. Portanto, pretendemos compreender se alterações na capacidade de fosforilação oxidativa(OXPHOS), no número e fenótipo das células T CD20⁺ no AT podem ser potenciais indicadores de progressão da doença metabólica.MÉTODOS: A respiração mitocondrial no AT de murganhos diabéticos, e de humanos com obesidade e distintos perfis metabólicos, foi avaliada por respirometria de alta resolução. Em murganhos, a expressão de proteínas mitocondriais (OXPHOS complexes e uncoupling protein-1, UCP-1) foi avaliada no AT por western blot e a produção de malondialdeído e capacidade antioxidante foram avaliados por cromatografia líquida de alta performance e espectrofotometria. A identificação e caracterização fenotípica e funcional das células T CD20⁺ foram efetuadas no sangue periférico (SP) (em humanos sem e com obesidade, em distintos perfis metabólicos) e no AT (humanos com obesidade), utilizando citometria de fluxo de doze cores.RESULTADOS: Em murganhos diabéticos, encontrámos alterações da capacidade OXPHOS do AT devido a diabetes já estabelecida. Foi observada uma elevada expressão de UCP-1 e complexos mitocondriais (CIII, CIV) em AT perivascular torácico (tPVAT) comparado ao AT inguinal (iWAT), independente da diabetes. Marcadores de stress oxidativo estavam diminuídos em tPVAT em comparação com iWAT, enquanto que a capacidade OXPHOS foi maior em tPVAT. A capacidade OXPHOS associada à oxidação de ácidos gordos (FAO) encontra-se elevada em murganhos diabéticos mesmo com a inibição da UCP-1, comparando com murganhos não-diabéticos. Em humanos com obesidade, encontrámos alterações na capacidade OXPHOS do AT ao longo da progressão da doença metabólica. A capacidade OXPHOS foi maior no tecido adiposo omental (OAT) do que no tecido adiposo subcutâneo (SAT). Observámos uma eficiência de acoplamento bioquímico reduzida no AT, explicitamente no SAT, em indivíduos com obesidade IR normoglicémicos (OB-IR-NG) e em indivíduos com diabetes (OB-IR-T2D), devido ao desacoplamento patológico. Enquanto que a eficiência do acoplamento associada a FAO foi maior em OB-IR-NG em SAT e OAT. A cirurgia bariátrica aprimorou respiração mitocondrial em OAT, mesmo sem eficiência de acoplamento OXPHOS.Em humanos sem obesidade (nOB), as células T CD20⁺ do SP apresentam um fenótipo de memória, alto nível de ativação e suscetibilidade para serem imunorreguladas pelo eixo PD-1/PD-L1, comparativamente às células T CD20⁻ dos mesmos indivíduos. Uma percentagem significativa destas células revelou ter capacidade para produzir simultaneamente as citocinas pró-inflamatórias TNF-⍺, IFN-γ e IL-17. Em humanos com obesidade, OAT apresentou uma maior percentagem de células T CD20⁺ do que SP e SAT. Em comparação com o SP, as células T CD20⁺ em OAT, estavam mais polarizadas para T1-like, sendo encontrada uma alta percentagem de células T CD4⁺CD20⁺IFN-γ⁺. Curiosamente, OB-IR-NG apresentaram uma menor percentagem e número absoluto de células T CD8⁺CD20⁺ circulantes em relação aos nOB, e maior percentagem de células Tc1 CD20⁺PD-1⁺ no SP comparativamente a indivíduos com obesidade insulino-sensíveis (OB-IS). Em relação à ativação, OB-IR-T2D apresentaram células T CD4⁺CD20⁺ circulantes menos ativadas do que OB-IS. Similarmente, a percentagem de células Tc1/17 CD20⁺ ativadas em OAT foi menor em OB-IR-T2D do que em OB-IS e indivíduos com pré-diabetes (OB-IR-PD). OAT de OB-IR-T2D também apresentou uma menor percentagem de células Tfh CD20⁺ ativadas comparando com OB-IS e OB-IR-NG. A percentagem de células Tfh CD20⁺ ativadas em OAT encontra-se inversamente correlacionada com os níveis de HbA1c. Após a cirurgia bariátrica, ocorreu um aumento na proporção de células T CD4⁺CD20⁺ no SP, com redução da polarização Th1, mas às custas do aumento de Th17. Em OAT, embora a predominância de células Th1 CD20⁺ tenha sido mantida após a cirurgia, foi observado um aumento de Th1/17 e Tc1/17.CONCLUSÃO: Este estudo tenta compreender os potenciais mecanismos subjacentes a resistência à insulina relacionada à obesidade no OAT, pré e pós-cirurgia bariátrica. Fizemos análises detalhadas da capacidade OXPHOS e do papel das células T CD20⁺ no infiltrado imune do AT, de indivíduos com obesidade, em distintos estágios de dismetabolismo. OB-IR-T2D apresentou a menor capacidade de OXPHOS e a menor percentagem de células T CD20⁺ ativadas em OAT. O OAT dos grupos OB-IR-NG e OB-IR-PD apresentou certa capacidade de adaptação imunometabólica. A avaliação da capacidade oxidativa e a contagem e caracterização fenotípica de células T CD20⁺ em tecidos frescos podem ser ferramentas úteis para o diagnóstico precoce de doença metabólica.