Dermatophytes Infections In Cape Verde: Epidemiological Trends and Ethnopharmacological Approach to Treatment

Abstract

As dermatofitoses são doenças infeciosas superficiais, que pela sua transmissibilidade podem ter como alvo qualquer indivíduo em qualquer idade, representando um problema de saúde mundial com alta prevalência, principalmente em países com sistemas de saúde mais débeis, como acontece em África, bem como entre crianças em idade escolar, para as quais existe um número limitado de tratamentos. Ultimamente, tem havido uma tendência no sentido de incrementar o uso de produtos naturais, derivados de plantas medicinais, pois acredita-se que estes tenham menos efeitos colaterais. Embora seja verdade que os produtos naturais têm valor medicinal, é imprescindível ter evidências científicas para demonstrar por um lado os seus usos medicinais, mas também para garantir que a sua utilização é segura. Na medicina tradicional Cabo-verdiana, a Withania chevalieri é utilizada pelas suas diversas propriedades medicinais. No entanto, os dados científicos sobre sua composição ou atividade medicinal não estão documentadas. Os objetivos principais deste estudo centraram-se na caracterização da infeção por dermatófitos em Cabo Verde em particular na população pediátrica em idade escolar e ainda na caracterização de um extrato etanólico de W. chevalieri, no que se refere à composição química e à sua bioatividade, com particular foco na atividade anti-dermatofítica. Determinou-se a prevalência de infeções por dermatófitos em três escolas primárias da cidade de Achada Igreja. Um total de 249 estudantes foram observados, tendo sido encontradas 60 crianças com lesões suspeitas de infeção por dermatófitos. Destas crianças foram colhidas amostras de cabelo, unhas e raspagem de pele, dependendo do local da lesão, tendo-se procedido à documentação fotográfica destas lesões. Estas amostras foram cultivadas em placas de agar de Sabouraud contendo cloranfenicol com e sem cicloheximida. Os isolados foram morfologicamente identificados e confirmados por sequenciação do rDNA da região ITS. Apenas foram obtidos 19 isolados de dermatófitos, o que indicou uma prevalência de dermatofitoses de 7,6%, um valor mais baixo do que aquele que é normalmente encontrado em países africanos. Trichophyton soudanense foi a espécie mais prevalente, responsável por diferentes padrões de infeção. Sendo W. chevalieri o produto natural mais utilizado em Cabo Verde como uma estratégia de etnomedicina para erradicar as dermatofitoses, realizou-se um estudo detalhado para a caracterização química e a bioatividade in vitro de um extrato etanólico de W. chevalieri (doravante designado WcCEE, do inglês “Withania chevalieri crude ethanolic extract”), com ênfase no seu efeito anti-dermatofítico. O WcCEE foi caracterizado quimicamente, por análise de HPLC. A sua atividade anti-dermatofítica foi avaliada por abordagens complementares como a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM), o “Time-Kill” e os efeitos sinérgicos quando em combinação com agentes anti-dermatofíticos utilizados em medicina convencional, por ensaios de “checkerboard”. Além disso, o possível mecanismo de ação foi investigado por várias abordagens, incluindo a quantificação dos componentes da parede celular e da membrana, complementadas por imagens de microscopia eletrónica de transmissão (TEM). O desenvolvimento de resistência foi avaliado por exposição seriada ao WcCEE. A potencial ação antioxidante foi analisada, in vitro, por métodos baseados em células e pela determinação da atividade antioxidante celular. Já a atividade anti-inflamatória foi estudada usando um modelo de linha celular de macrófago ativado por lipopolissacarídeo bacteriano. A atividade anticancerígena foi avaliada usando diferentes linhagens celulares cancerígenas humanas. A sua citotoxicidade foi avaliada em linhagens celulares não tumorais e queratinócitos humanos (HaCat), por ensaios colorimétricos. Quimicamente, verificou-se que o WcCEE é composto por compostos polifenólicos ativos, aos quais são atribuídas propriedades medicinais. O WcCEE apresentou atividade fungicida dependente da concentração sobre os dermatófitos testados, com valores de CIM de 1,56 a 25 mg/mL, e interação sinérgica com todos os antidermatófitos convencionais testados, especialmente com a terbinafina. O WcCEE não provocou o desenvolvimento de resistência em nenhuma das estirpes de dermatófitos testadas. Um aumento significativo, para algumas estirpes, no ergosterol e nos componentes da parede celular foi observado após a exposição dos fungos ao extrato, possivelmente devido a um mecanismo de escape adaptativo usado pelo fungo para manter sua integridade. No entanto, as alterações morfológicas evidentes indicaram a eficácia do WcCEE em provocar dano nas células fúngicas, possivelmente por lise. Além disso, ensaios in vitro demonstraram forte atividade antioxidante e anti-inflamatória, além do notável efeito inibitório ao diminuir o crescimento celular de várias linhagens celulares cancerígenas, especialmente de cân

Dermatophytoses are superficial infectious diseases, which, due to their transmissibility, can affect any individual at any age, representing a worldwide health problem with high prevalence, mainly in countries with low public health systems, as in Africa, particularly among school-age children, for whom there is a limited number of treatments. Lately, there has been a tendency to explore natural products as therapeutic alternatives to conventional antifungals, especially those derived from medicinal plants, as natural products are believed to have fewer side effects and induce less resistance. While it is true that natural products have medicinal value, it is important to gather scientific evidence supporting the suggested medicinal activities and to ensure their safe use. In traditional Cape Verdean medicine, Withania chevalieri is used for its various medicinal properties. However, there are no scientific data on its composition or its medicinal activities. The main objectives of this study were centered on the characterization of dermatophyte infection in Cape Verde, particularly in the school-age pediatric population, and also on the characterization of the ethanolic extract of W. chevalieri, concerning its chemical composition and bioactivity, with a particular focus on antidermatophytic activity. The prevalence of dermatophyte infections was determined in three primary schools in the city of Achada Igreja. A total of 249 students were observed, and 60 children were found with lesions suspected of dermatophyte infection. From these children, samples of hair, nails and, skin scrapings were collected, depending on the site of the lesion, and photographic documentation of these lesions was carried out. These samples were grown on Sabouraud's agar plates containing chloramphenicol with and without cycloheximide. The isolates were morphologically identified and confirmed by rDNA sequencing of the ITS region. Only 19 dermatophyte isolates were obtained, which indicated a dermatophytoses prevalence of 7.6%, a lower value than that normally found in African countries. Trichophyton soudanense was the most prevalent species, responsible for different patterns of infection. Since W. chevalieri is the most used natural product in Cape Verde as an ethnomedicine strategy to eradicate dermatophytoses, a detailed study was carried out for the chemical characterization and in vitro bioactivity of an ethanolic extract of W. chevalieri (hereinafter referred to as WcCEE, from English “Withania chevalieri crude ethanolic extract”), with emphasis on its anti-dermatophytic effect. WcCEE was chemically characterized by HPLC analysis. Its anti-dermatophytic activity was evaluated by complementary approaches such as the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC), the "Time-Kill" and the synergistic effects when combined with anti-dermatophytic agents used in conventional medicine, by checkerboard assays. Furthermore, the possible mechanism of action was investigated by various approaches, including quantification of cell wall and membrane components, complemented by transmission electron microscopy (TEM) imaging. Resistance development was assessed by serial exposure to WcCEE. The potential antioxidant action was analyzed, in vitro, by cell-based methods and by determination of cellular antioxidant activity. The anti-inflammatory activity was studied using a macrophage cell line model activated by bacterial lipopolysaccharide. Anticancer activity was evaluated using different human cancer cell lines. Its cytotoxicity was evaluated in non-tumor cell lines and human keratinocytes (HaCat), by colorimetric assays. Chemically, it was found that WcCEE is composed of active polyphenolic compounds, to which medicinal properties are attributed. WcCEE showed concentration-dependent fungicidal activity on the dermatophytes tested, with MIC values from 1.56 to 25 mg/mL, and synergistic interaction with all conventional antidermatophytic tested, especially with terbinafine. WcCEE did not cause resistance to develop in any of the dermatophyte strains tested. A significant increase, for some strains, in ergosterol and cell wall components was observed after exposing the fungi to the extract, possibly due to an adaptive escape mechanism used by the fungus to maintain its integrity. However, the evident morphological changes indicated the effectiveness of WcCEE in causing fungal cell damage, possibly by lysis. In addition, in vitro, assays have demonstrated strong antioxidant and anti-inflammatory activity, in addition to the remarkable inhibitory effect by decreasing cell growth of several cancer cell lines, especially lung cancer (NCI-H460), with low toxicity to normal cell lines and human keratinocytes.In conclusion, although the real prevalence of dermatophytoses and dermatophytes in the Cape Verde archipelago cannot be definitively established by the data obtained in this study