Functional characterization of epigenetic markers during micropropagation

Abstract

Plant regeneration is a well-known capacity of plants occurring either in vivo or in vitro. This potential requires a change in cell fate and pluripotency reacquisition, and is the basis for plant micropropagation. In particular, somatic embryogenesis (SE) is a developmental pathway by which somatic plant cells reprogram, acquire totipotency, and embark into somatic embryo formation. This valuable plant biotechnology tool has been widely used in the large-scale micropropagation and improvement of numerous economically relevant crops, for genetic transformation protocols and to study different aspects of plant development. Nevertheless, certain challenges hinder its wider application in woody species, such as the loss of embryogenic competence during subcultures and low somatic embryo conversion rates. Several epigenetic markers have emerged as regulators of many developmental transitions in plants, mainly DNA methylation and, to a lower extent, histone modifications and regulation by specific classes of non-coding RNAs (ncRNAs). However, the regulatory molecular mechanisms underlying plant somatic cell reprogramming towards embryogenic competence commitment remain not fully understood.Somatic embryogenesis in Solanum betaceum Cav. (tamarillo) is a two-step process, that enables the long-term maintenance of cell lines with the same genetic background but different morphogenetic competencies – embryogenic callus (EC), long-term callus (LTC) and non-EC (NEC). In this way, S. betaceum SE represents a good system to study the molecular mechanisms involved in the acquisition, expression and maintenance of embryogenic competence. Using this woody species, the main goal of this Ph.D. thesis was to gain insight into the regulatory roles of specific epigenetic markers and gene transcription regulators in the SE process, focusing on the loss of the callus embryogenic potential throughout subcultures. For that, several methodologies were applied and protocols optimized for this species, such as selection and validation of reference genes for RT-qPCR data normalization, Agrobacterium-mediated genetic transformation, and barcoded cDNA libraries preparation from poly(A) RNA.Starting with the functional characterization of miR399b and miR827 in S. betaceum calli, the findings presented point to the validation of the hypothesis that long exposure to high sucrose concentrations during subcultures leads to the loss of embryogenic competence, through phosphate-starvation mechanisms.Long-read sequencing using Nanopore® technology was performed on S. betaceum cell lines with distinct cell fates. Sixty lncRNA candidates were identified based on their coding potential. Expression patterns of lncRNAs were compared among EC, LTC and NEC. Upregulated lncRNAs in EC and LTC were predicted to target embryogenesis-related genes,11while those upregulated in NEC were predicted to target genes involved in auxin and ethylene signalling and carbohydrate metabolism.Histone H3 methylation at lysine 9 (H3K9me), a repressive histone modification, was analyzed in proliferative calli and during somatic embryo development initiation, through quantification of global H3K9me levels and H3K9me2 immunolocalization. While the proliferating EC, LTC and NEC showed moderate global H3K9me levels, with no significant differences among them, during somatic embryo development initiation, a gradual increase was found, with significantly higher methylation levels after 4 weeks of EC incubation on the development medium. Immunofluorescence analysis revealed a heterogenous signal distribution of H3K9me2 among cells of the different cell lines, with lower labelling in cells with embryogenic-like features. In contrast, the H3K9me2 signal progressively increased during somatic embryo development, being highest on cells forming the protrusions that emerged from the EC surface and from which the embryos would form.Ultimately, the results from this PhD thesis contribute to a better understanding of the molecular regulatory networks underlying the induced embryogenic competence in S. betaceum. Also, the knowledge and methodologies available in epigenetics research on model plants were transferred to a non-conventional model system, enlarging the set of tools available. Altogether, these findings may allow the development of new strategies to improve the manipulation of plant cloning conditions, which is of great importance to overcome the recalcitrance of the SE and increase the efficiency of the process in some crops.

A capacidade de regeneração é bem conhecida nas plantas e ocorre quer in vivo quer in vitro. Este potencial requer uma alteração da determinação celular e a reaquisição da pluripotência, e constitui a base da micropropagação das plantas. Em particular, a embriogénese somática (ES) é uma via de desenvolvimento através da qual as células vegetais somáticas se reprogramam, adquirem totipotência e embarcam na formação de embriões somáticos. Esta valiosa ferramenta da biotecnologia vegetal tem sido amplamente utilizada na micropropagação em grande escala e no melhoramento de numerosas culturas de interesse económico, em protocolos de transformação genética e no estudo de diferentes aspetos do desenvolvimento das plantas. No entanto, alguns desafios impedem a sua aplicação mais ampla em espécies lenhosas, como a perda de competência embriogénica durante as subculturas e as baixas taxas de conversão de embriões somáticos. Vários marcadores epigenéticos surgiram como reguladores de muitas transições de desenvolvimento nas plantas, principalmente a metilação do DNA e, em menor grau, as modificações das histonas e a regulação por alguns RNAs não codificantes (ncRNAs). No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a reprogramação das células somáticas das plantas para a aquisição de competência embriogénica não estão ainda totalmente compreendidos.A embriogénese somática em Solanum betaceum Cav. (tamarilho) é um processo em duas etapas, que permite a manutenção a longo prazo de linhas celulares com o mesmo fundo genético, mas com diferentes competências morfogenéticas - calo embriogénico (CE), calo de longa duração (LTC) e calo não embriogénico (CNE). Desta forma, a ES em S. betaceum representa um bom sistema experimental para estudar os mecanismos moleculares envolvidos na aquisição, expressão e manutenção da competência embriogénica. Utilizando esta espécie lenhosa, o principal objetivo desta tese de doutoramento foi compreender os papéis reguladores de marcadores epigenéticos específicos e reguladores de transcrição de genes no processo de ES, focando a perda do potencial embriogénico do calo ao longo das subculturas. Para tal, foram aplicadas várias metodologias e otimizados protocolos para esta espécie, tais como a seleção e validação de genes de referência para normalização de dados de RT-qPCR, transformação genética mediada por Agrobacterium e preparação de bibliotecas de cDNA com barcodes a partir de poli(A) RNA.Começando com a caraterização funcional de miR399b e miR827 em calos de S. betaceum, os resultados apresentados apontam no sentido da validação da hipótese de que a longa exposição a altas concentrações de sacarose, durante as subculturas, leva à perda de competência embriogénica, através de mecanismos de privação de fosfato.A sequenciação de reads longas utilizando a tecnologia Nanopore® foi efetuada em linhas celulares de S. betaceum com capacidades embriogénicas distintas. Sessenta candidatos a longos13ncRNA (lncRNAs) foram identificados com base no seu potencial codificante. Os padrões de expressão dos lncRNAs foram comparados entre CE, LTC e NEC. Da previsão de genes-alvo, para os lncRNAs com maior expressão em CE e LTC, foram previstos como alvos genes relacionados com a embriogénese, enquanto que os lncRNAs com uma maior expressão em NEC tiveram como previsão genes-alvo envolvidos na sinalização das auxinas e do etileno e no metabolismo dos hidratos de carbono.A metilação da histona H3 na lisina 9 (H3K9me), uma modificação repressiva da histona, foi analisada em calos em proliferação e durante o início do desenvolvimento de embriões somáticos, através da quantificação dos níveis globais de H3K9me e da imunolocalização de H3K9me2. Enquanto os CE, LTC e NEC em proliferação apresentaram níveis globais moderados de H3K9me, sem diferenças significativas entre eles, durante o início do desenvolvimento do embrião somático em CE, verificou-se um aumento gradual dos níveis de metilação, significativamente mais elevados após 4 semanas de incubação no meio de desenvolvimento. A análise de imunofluorescência revelou uma distribuição heterogénea do sinal de H3K9me2 entre as células das diferentes linhas celulares, com menor marcação nas células com características semelhantes às embriogénicas. Em contraste, o sinal H3K9me2 aumentou progressivamente durante o desenvolvimento do embrião somático, sendo mais elevado nas células que formavam as saliências que emergiam da superfície do CE e das quais se formariam os embriões.Em suma, os resultados desta tese de doutoramento contribuem para uma melhor compreensão das redes de regulação molecular subjacentes à competência embriogénica induzida em S. betaceum. Além disso, o conhecimento e as metodologias disponíveis na investigação epigenética em plantas modelo foram transferidos para um sistema modelo não convencional, alargando o conjunto de ferramentas disponíveis para esta espécie. Assim, estes resultados poderão permitir o desenvolvimento de novas es