Novel Metal Radiopharmaceuticals for Theranostics in Oncology and Neuroscience

Abstract

O trabalho apresentado nesta tese tem como foco principal a síntese, caracterização e avaliação de uma série de radiofármacos baseados em radiometais, com vista ao desenvolvimento de ferramentas valiosas para translação clínica, particularmente nas áreas de oncologia e neurociência. A pesquisa visa fornecer informações e aplicações importantes para o diagnóstico e tratamento nessas duas grandes áreas.O Capítulo 1 apresenta uma revisão da literatura, focando-se nos principais temas desenvolvidos no decorrer do trabalho experimental, nomeadamente nas estratégias de radiomarcação de biomoléculas com radionuclídeos convencionais ou emergentes. As características físicas e químicas dos emissores de positrões foram também minuciosamente revisadas nesta tese, com foco especial em dois radioisótopos, zircónio-89 e cobre-64. Além disso, a imunoterapia foi também explorada.O Capítulo 2 descreve os objetivos específicos desta tese, incluindo uma explicação detalhada da importância e potencial impacto desta pesquisa.O Capítulo 3 descreve o desenvolvimento de anticorpos monoclonais (mAb) marcados com zircónio-89 como possíveis sondas de Tomografia por Emissão de Positrões (PET) para o diagnóstico oncológico precoce. O primeiro subtópico discute a otimização do processo global de radiomarcação, incluindo a síntese e caracterização de conjugados, seguida de sua marcação com zircónio-89. Foram utilizados dois mAbs neste estudo, nomeadamente o Trastuzumab, um antirrecetor da proteína promotora de crescimento conhecida como HER2, e o Pembrolizumab, um antirrecetor da proteína de morte programada-1 (PD-1). A radiomarcação desses dois anticorpos foi alcançada com sucesso. Nos subtópicos seguintes, foram efetuados estudos pré-clínicos do radiofármaco [89Zr]Zr-DFO-Trastuzumab, incluindo estudos de estabilidade in vitro em condições fisiológicas, ensaios celulares, imagem PET e estudos de biodistribuição em murganhos. Estes estudos revelaram alta estabilidade do marcador [89Zr]Zr-DFO-Trastuzumab em meios fisiológicos, alta afinidade e seletividade para o recetor HER2 e, uma elevada acumulação específica de [89Zr]Zr-DFO-Trastuzumab, 168 h pós-injeção em tumores sensíveis ao Trastuzumab. Ainda, foi realizada a translação clínica usando [89Zr]Zr-DFO-Pembrolizumab. Nove doentes diagnosticados com cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram injetados com este radiofármaco para avaliar o desempenho da imagem imuno-PET. As imagens de corpo inteiro obtidas no dia 7 revelaram acumulação seletiva de [89Zr]Zr-DFO-Pembrolizumab no tecido neoplásico.O Capítulo 4 apresenta, além do processo de marcação com lutécio-177, estudos terapêuticos em animais utilizando duas abordagens diferentes: radioimunoterapia com [177Lu]Lu-DOTA-Trastuzumab e terapia convencional com Trastuzumab. Demonstrou-se que a terapêutica com [177Lu]Lu-DOTA-Trastuzumab é mais promissora em comparação com a terapêutica com Trastuzumab, evidenciado pelo aumento da sobrevida dos murganhos portadores de tumores HER2 positivo.O capítulo 5 descreve o desenvolvimento de um novo radiofármaco baseado em nanocorpos (Nb) marcado com cobre-64, com vista a obter um marcador específico para a forma de β-amilóide (Aβ) para o diagnóstico precoce da doença de Alzheimer (AD). Adicionalmente, foi incluído um estudo comparativo entre o cobre-64 produzido a partir de alvos líquidos e sólidos. Dois marcadores imuno-PET, [64Cu]Cu-NODAGA-Nb e [64Cu]Cu-NOTA-Nb, foram desenvolvidos com sucesso com alta pureza radioquímica e atividades específicas adequadas para estudos pré-clínicos, a partir de ambos os alvos - líquidos e sólidos. Ambos os radiofármacos foram comparados com o padrão [64Cu]Cu-DOTA-Trastuzumab. Foram ainda realizados estudos de biodistribuição com um marcador selecionado, [64Cu]Cu-NODAGA-Nb, que revelaram excreção renal e depuração eficiente de órgãos saudáveis.Por último, no Capítulo 6, apresentam-se as principais conclusões e perspetivas futuras.

The work presented in this thesis is primarily focused on the synthesis, characterization, and evaluation of a series of metal-based radiotracers. These tracers are intended to be used as valuable tools for clinical translation, particularly in the fields of oncology and neuroscience. The research aims to provide important insights and applications that can potentially advance diagnosis and treatment in these fields.In Chapter 1 the state-of-the-art literature is revised, focusing on the main subjects developed throughout the experimental work, namely on the radiolabeling strategy for biomolecules with common or emerging radionuclides. The physical and chemical characteristics of positron emission were thoroughly revised in this thesis, with a special focus on two radioisotopes, zirconium-89 and copper-64. Immunotherapy was also explored. Chapter 2 outlines the specific objectives of this thesis, including a detailed explanation of the significance and potential impact of this research.Chapter 3 describes the development of 89Zr-labeled monoclonal antibodies (mAb) as potential Positron Emission Tomography (PET) probes for early cancer diagnosis. The first subtopic discusses the optimization of the radiolabeling process, including the synthesis and characterization of immunoconjugates, followed by their radiolabeling with zirconium-89. Two antibodies, Trastuzumab for human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) targeting, and Pembrolizumab for programmed cell death (PD-1) receptor targeting were used. Successful radiolabeling of these antibodies was achieved. In the subsequent subtopics, the pre-clinical evaluation of [89Zr]Zr-DFO-Trastuzumab was carried out. This evaluation included in vitro stability in physiological conditions, binding assay, PET imaging, and biodistribution studies. These studies showed high stability of the [89Zr]Zr-DFO-Trastuzumab radiotracer, demonstrated high affinity and selectivity for HER2 receptor, and exhibited a clear and specific high accumulation of [89Zr]Zr-DFO-Trastuzumab in trastuzumab-sensitive tumors after 168 h post-injection. Finally, clinical translation using [89Zr]Zr-DFO-Pembrolizumab was conducted in nine patients diagnosed with non-small cell lung cancer (NSCLC) to assess the immune-PET imaging performance. The obtained whole-body images on day 7 revealed selective accumulation of [89Zr]Zr-DFO-Pembrolizumab at tumor sites.In Chapter 4, in addition to the radiolabeling process using lutetium-177, therapeutic studies in animals were investigated using two different strategies: radioimmunotherapy with [177Lu]Lu-DOTA-Trastuzumab and conventional therapy with Trastuzumab alone. We found that using [177Lu]Lu-DOTA-Trastuzumab is more promising, as evidenced by increased survival of mice-bearing tumors compared with the treatment using only trastuzumab. Chapter 5 focuses on the development of a novel, smaller radiotracer-based nanobody (Nb) radiolabeled with copper-64 to target the specific form of β-amyloid (Aβ) for early diagnosis of Alzheimer’s disease (AD). Additionally, a comparative study between copper-64 produced from liquid and solid targets was included. Two immuno-PET tracers, [64Cu]Cu-NODAGA-Nb and [64Cu]Cu-NOTA-Nb, were successfully developed, from both liquid and solid targets, with high radiochemical purity and specific activities suitable for further in vivo pre-clinical imaging studies. These tracers were compared to the standard [64Cu]Cu-DOTA-Trastuzumab. With the one selected novel radiotracer, [64Cu]Cu-NODAGA-Nb, further very preliminary in vivo studies were performed. Biodistribution studies revealed renal excretion and efficient clearance from healthy organs.Finally, in Chapter 6, the thesis concludes with summarizing remarks and future perspectives, highlighting the key findings and contributions of the research presented.