Mushroom enriched-diets to ameliorate mitochondrial disfunction in Wilson disease

Abstract

O papel desempenhado pelos metais, especialmente o cobre, é atualmente um tema de investigação com novas evidências científicas a apontarem para alterações no metabolismo dos lípidos e interações com proteínas que podem impactar a sua função/estrutura e, em última instância, levar à morte celular (cuproptose) pelo desequilíbrio nos níveis de cobre. Na doença de Wilson (DW), a excreção hepática do cobre é reduzida devido a mutações no transportador de cobre ATPase ATP7B, levando a alterações mitocondriais e esteatose, características que se observam também na doença do fígado gordo não-alcoólico (NAFLD). Além disso, os tratamentos aprovados atualmente para a DW, especialmente os sais de zinco, têm um regime de tratamento muito rigoroso e causam frequentemente problemas gastrointestinais tais como gastrite, erosões e úlceras. Assim sendo, neste projeto de investigação foi desenvolvida uma nova abordagem nutritiva, baseada num micélio de cogumelo enriquecido com zinco, "bio-zinco", com o objetivo de criar uma terapia alternativa para ajudar no tratamento de doentes com DW. O consumo de espécies de cogumelos comestíveis e/ou medicinais como alimento ou suplemento é uma prática comum desde à vários séculos, e os seus efeitos benéficos para a saúde já foram comprovados em doenças como a diabetes mellitus tipo 2, obesidade, colesterol elevado, hipertensão e cancro. Curiosamente, a capacidade dos cogumelos para sequestrar e acumular metais, nomeadamente cobre e zinco, está também a ser documentada. O "bio-zinco" representa uma opção terapêutica que ajudaria a diminuir a absorção do cobre no trato gastrointestinal, quer ligando diretamente o metal no lúmen e promovendo a sua excreção através das fezes, quer imitando o mecanismo promovido pelos sais de zinco, de uma forma menos irritável. Contudo, enquanto o fenótipo hepático é bem conhecido na DW, a disfunção do transportador ATP7B, a acumulação de cobre e as consequências fenotípicas no intestino têm sido largamente negligenciadas. Desta forma, a investigação do fenótipo intestinal na DW tornou-se um objetivo adicional deste trabalho de investigação. Para abordar ambas as questões científicas, nomeadamente: 1) Se o cogumelo enriquecido com zinco é benéfico como terapia num cenário de toxicidade ligada ao cobre, mais precisamente na DW, e 2) Quais são as alterações fisiopatológicas no intestino, um modelo animal para a DW (ratos LPP, Atp7b-/-), com ênfase no seu fenótipo intestinal, em paralelo com a linha de celular humana Caco-2, e a sua correspondente linha celular mutada para a proteína ATP7B (ATP7B KO) foram utilizadas. Os resultados em ambos os modelos foram: 1) alterações estruturais nas mitocôndrias, sem um aumento significativo do teor de cobre, 2) alterações na expressão de proteínas relacionadas com a função das mitocôndrias, metabolismo energético e processamento lipídico, 3) diminuição da permeabilidade da barreira intestinal. No modelo celular ATP7B KO, a função mitocondrial e a integridade da barreira foram melhoradas com o tratamento com o quelante de cobre Metanobactina (MB). Além disso, o extrato de proteína de micélio enriquecido com zinco foi protetor contra a toxicidade do cobre nas Caco-2, demonstrando também um efeito positivo na integridade da barreira, e na expressão da proteína metalotioneína. Adicionalmente, num primeiro estudo em que os ratos LPP foram alimentados com o "bio-zinco", observou-se alterações nos níveis de metais (zinco e cobre) no intestino superior e um potencial aumento na absorção de zinco. Em conclusão, uma expressão reduzida do transportador de cobre ATP7B tem consequências no intestino, com efeitos positivos do "bio-zinco" observados nas células, assim como indicações da modulação dos níveis de metais no intestino, após a alimentação de ratos LPP com o micélio enriquecido com zinco. Em suma, neste trabalho de investigação foram apresentadas novas evidências científicas no que diz respeito a alterações intestinais na DW, juntamente com os primeiros resultados promissores do tratamento com o "bio-zinco", reforçando a importância de desenvolver alternativas nutricionais, e mais sustentáveis, para melhorar a qualidade de vida dos doentes com DW, ou de pacientes com outras patologias relacionadas com o cobre. Foi realizada uma extensa otimização protocolar, quer para a produção e validação do micélio enriquecido com zinco, quer para o estabelecimento de análises do intestino dos animais e diferenciação das células Caco-2 numa barreira que simula a barreira intestinal. No seu conjunto, este trabalho de otimização permitirá no futuro aprofundar a investigação sobre o tema no que diz respeito a: 1)estudar os mecanismos moleculares por detrás da toxicidade do cobre no intestino dos ratos LPP; 2)aprofundar o conhecimento relacionado com a disfunção mitocondrial nas células (Caco-2) e no intestino dos ratos LPP e 3)avaliar os efeitos positivos da dieta do micélio enriquecido com zinco, em ambos os modelos de DW

The role played by metals, especially copper, is currently a topic of research with new scientific evidences pointing to alterations in lipid metabolism, and protein-linked damaged that ultimately can lead to cell death (cuproptosis) upon copper misbalance. In Wilson disease (WD), impaired hepatic copper excretion due to mutations in the copper-transporting ATPase ATP7B, causes mitochondrial alterations and steatosis, shared features with the Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Furthermore, currently approved therapeutics for WD, especially zinc salts, have a very strict treatment regimen and frequently cause gastrointestinal problems such as gastritis, erosions and ulcers. With this in mind, a new dietary approach, based on a zinc-enriched mushroom mycelium, “bio-zinc”, was developed in this research project, with the aim of creating a nutritional based-therapy to help in the treatment of WD patients. Edible and medicinal mushrooms have long been consumed as food or as a supplement, and have proved health beneficial effects in several conditions, from type 2 diabetes mellitus (T2DM), to obesity, hyperlipidemia, hypertension and cancer. Interestingly, the capacity of mushrooms to sequestrate and accumulate metals, namely copper and zinc, is also becoming well-documented. The “bio-zinc” represents a milder therapeutic option that would help to decrease copper absorption in the gastrointestinal tract, either by directly binding the metal in the lumen and promoting its excretion via the feces or by mimicking the mechanism promoted by the zinc salts, in a less irritable way. However, whereas the hepatic phenotype is well known in WD, ATP7B malfunction, copper accumulation, and phenotypical consequences in the intestine have been largely overlooked. Therefore, the investigation of the intestinal phenotype in WD became a further aim of this research work. To address both scientific questions, meaning: 1) Is the zinc-enriched mushroom beneficial as a therapy in a copper-linked toxicity scenario, more precisely in WD, and 2) What are the pathophysiologic alterations in the intestine of WD, an in vivo model for WD (LPP rats, Atp7b-/-), with emphasis on its intestinal phenotype, in parallel with the human cell line Caco-2, and its correspondent ATP7B Knockout (KO) cell line were used. The results in both models were: 1) structural changes in mitochondria without a significant increase in copper content, 2) changes/alterations in the expression of proteins related to mitochondria function, energy metabolism, and lipid processing, and 3) decreased barrier tightness. In the ATP7B KO cellular model, mitochondrial function and barrier integrity were improved upon treatment with the high-affinity copper chelator Methanobactin (MB). Furthermore, the zinc-enriched mycelium protein extract was protective against copper toxicity in Caco-2 cells, with a positive effect on barrier integrity and metallothionein expression. Additionally, in LPP rats, a short feeding study demonstrated that this nutritional “bio-zinc” approach can change metal values (zinc and copper) in the upper intestine of these animals, together with a potential increase in zinc uptake. In conclusion, a reduced ATP7B expression has consequences in the intestine, with the first positive effects of the “bio-zinc” observed in vitro, as well as indications of intestinal metal levels modulation after feeding LPP rats with this enriched mushroom mycelia. In conclusion, in this research work, new evidence with regards to intestinal alterations in WD was first described, together with the first promising results with the “bio-zinc” treatment, reinforcing the importance of developing new nutritional, and more sustainable, therapeutic alternatives to improve the life quality of patients with Wilson disease or other metal-related pathologies. Extensive protocol optimization was undertaken, either for the production and validation of the zinc-enriched mycelium, as well as with the establishment of, on one hand, different intestinal analysis from the animals and, on the other hand, the in vitro differentiation of Caco-2 cells in an enterocyte-like barrier. Altogether, this work will allow further research on the topic to 1) study the molecular mechanisms behind copper toxicity in the intestine of WD animals; 2) shed light on the mechanisms related to mitochondrial dysfunction, and 3) evaluate the positive effects of the zinc-enriched mycelium diet in both in vitro and in vivo models.