Development of a tumour-targeted strategy for photodynamic therapy

Abstract

Terapia fotodinâmica (PDT) combina o uso de um fotossensibilizador (PS), irradiação de luz, a um comprimento de onda específico, e oxigénio para matar células através da geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Está estabelecida como uma terapia contra o cancro, minimamente invasiva, que consegue atacar células cancerígenas com precisão, através da irradiação. Outras vantagens, comparando a terapias anticancerígenas tradicionais, incluem não criar resistência, tratamento com cicatrização mínima e imunidade antitumoral (relacionada com o controlo da doença a longo termo). Ainda assim, o efeito lateral mais comum é pele fotossensível por intervalos de tempo longos, após tratamentos de PDT, causados pela falta de selectividade dos PSs para tecido tumoral, o que leva a razões de concentração em tecidos tumoral/normal que não conseguem prevenir danos ao tecido saudável que se encontra à volta do tumor.De modo a ultrapassar este problema, diferente estratégia de direccionamento (targeting) têm sido utilizadas em investigação, envolvendo métodos passivos ou activos de targeting de receptores específicos que se encontram sobreexpressos em cancros, mas em níveis baixos ou negligentes em células normais. A conjugação de PSs a diferentes moléculas de targeting (e.g., ligandos endógenos, anticorpos ou factores de crescimento) tem sido um dos métodos mais usados, permitindo ao PS conjugado ser reconhecido especificamente por células cancerígenas. Nesta tese pusemos a hipótese de desenvolvimento de uma estratégia para PDT direccionado, focada em química de “clique” para tornar eficiente o processo de obtenção de conjugados direccionados a tumores a partir de clorinas obtidas através do método de ciclo adição [8π+2π], desenvolvido previamente no nosso grupo. Com a síntese de novas clorinas, propomos uma estratégia como prova de conceito, seguindo a síntese de PSs que possam participar em reacções de “clique” e a sua conjugação a uma molécula ligante que contenha ácido fólico (FA) para obter um conjugado direccionado selectivamente à isoforma alfa do receptor do folato (FRα), que normalmente está sobreexpressa em vários cancros.Sintetizámos um conjunto de novas 4,5,6,7-tetrahidropirazolo[1,5-a]pyridina-fused meso-tetra(3-hidroxifenil)clorinas com diferentes anfifilicidades através de derivatizações subsequentes, com a clorina mais hidrofílica da série mono funcionalizada ter sido derivatizada de novo para obter um grupo azida, para que pudesse participar em química de “clique” com outra molécula de targeting com um grupo alcino. Estas clorinas mostraram actividade fototóxica, a nível de concentrações nanomolares, contra um modelo altamente agressivo de cancro da mama triplo negativo, a linha celular humana de adenocarcinoma MDA MB 231. Especificamente, a clorina mono funcional mais hidrofílica (semelhante à temoporfina) obteve uma CI50 < 100 nM e a variante “clicável” obteve uma CI50 ~ 100 nM.A partir desse derivado “clicável”, desenhámos um conjugado para a nossa prova de conceito com base num ligante disponível comercialmente, que continha a parte do FA para targeting , um espaçador de polietileno glicol (PEG) com 1 kDa e o fragmento de dibenzociclooctino (DBCO) que contém o alcino para participar na reacção “clique”. Com a corroboração obtida da análise in silico de uma simulação de docagem molecular da ligação entre o PS conjugado e o FRα, seguimos com a síntese do nosso conjugado. No entanto, a dificuldade em purificar um compost tão grande, dificultou a sua caracterização e avaliação in vitro: mesmo sendo possível confirmer indirectamente a presença do conjugado para a nossa prova de conceito, este não mostrou aumento da eficácia da PDT nem na internalização celular, quando comparado às novas clorinas.Ainda assim, conseguir a síntese do conjugado para PDT direccionado apoiou a viabilidade do uso desta estratégia. Atingir este marco foi importante, porque apesar de diferentes estratégias para PDT direccionado terrem sido investigadas, ainda nenhuma chegou a ser usada na clínica. A nossa estratégia de conjugação permite uma adaptação fácil a outros alvos e/ou outras clorinas com boa actividade, tal como estamos a trabalhar de momento: síntese e caracterização de novos conjugados com 4,5,6,7-tetrahidropirazolo[1,5-a]pyridina-fused meso-tetra(3-hidroxifenil)clorinas obtidos a partir deste protocolo, mas direccionados ao receptor de biotina, utilizando um ligante simétrico e muito menor que permitirá uma purificação mais eficaz.

Photodynamic therapy (PDT) combines the use of a photosensitiser (PS), light irradiation at a specific wavelength, and oxygen to kill cells, through the generation of reactive oxygen species (ROS). It has been established as a minimally invasive anticancer therapy that can target tumour cells accurately through irradiation. Other advantages compared to traditional anticancer therapies also include lack of resistance, healing with minimal scarring, and anti tumour immunity (related to the long term control of the disease). Nevertheless, the most common side effect is prolonged skin photosensitivity after PDT treatment caused by the lack of selectivity of the PSs for tumour tissue, leading to tumour/normal tissue ratios that are not able to prevent damage to healthy tissue surrounding the tumours.In order to overcome this issue, different targeting strategies have been used in research involving either passive or active targeting of specific receptors that are overexpressed in cancers but at low or negligent levels in normal cells. The conjugation of PSs to different targeting moieties (e.g., endogenous ligands, antibodies, or growth factors) has been one of the most used methods, allowing for the conjugated PS to be specifically recognised by cancer cells. In this thesis we hypothesised a strategy for targeted PDT focused on “click” chemistry to streamline the process of obtaining tumour targeting conjugates from chlorins obtained using the [8π+2π] cycloaddition method, previously developed within our group. With the synthesis of novel chlorins, we propose a proof of concept strategy following the synthesis of a “clickable” PS and further conjugation to a linker containing folic acid (FA) to obtain a targeted PS selective to the alpha isoform of the folate receptor (FRα), which is usually found overexpressed in cancer cells.We synthesised a set of novel 4,5,6,7-tetrahydropyrazolo[1,5-a]pyridine-fused meso-tetra(3-hydroxyphenyl)chlorins with varying amphiphilicity through subsequent derivatisations, with the most hydrophilic chlorin from the mono functionalised series being further derivatised to obtain an azide group, so that it could participate in “click” chemistry with a targeting moiety containing an alkyne group. These chlorins showed phototoxic activity, in the nanomolar range, against the highly aggressive, triple negative breast cancer model, the MDA MB 231 human adenocarcinoma cell line. Specifically, the mono functional, most hydrophilic chlorin (similar to temoporfin) having an IC50 < 100 nM and its “clickable” derivative having an IC50 ~ 100 nM.From that “clickable” derivative we designed a conjugate for our proof of concept, based on a commercially available linker that contained the FA moiety for targeting, a 1 kDa polyethylene glycol (PEG) spacer, and the alkyne containing moiety, dibenzocyclooctyne (DBCO) to participate in the “click” reaction. With the corroboration obtained from the in silico analysis of a molecular docking simulation of the binding of the conjugated PS to FRα, we followed through with the synthesis of this conjugate. However, the difficulty in purifying such a large compound, hindered its characterization and in vitro evaluation: despite being able to indirectly confirm the presence of the proof of concept conjugate, it did not show an improvement in PDT efficacy nor on the cell uptake when compared to the novel chlorins.Nonetheless, the successful synthesis of the PDT targeted conjugate supported the viability of this targeting strategies. Reaching this milestone was important, because despite several targeted PDT strategies have been researched, a targeted PDT has yet to reach the clinic. Our conjugating strategy allows for an easy adaptation to be used with other targets and/or other chlorins with strong activity, as we are currently working now: synthesis and characterisation of new 4,5,6,7-tetrahydropyrazolo[1,5-a]pyridine-fused meso-tetra(3-hydroxyphenyl)chlorin conjugates obtained through this protocol, but targeting the biotin receptor, and working with a smaller, symmetrical linker that might allow for a more effective purification.