Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/114446
Title: Pharmacoresistant epilepsy focal: histopathological and molecular approach
Other Titles: Epilepsia focal farmacorresistente: abordagem histopatológica e molecular
Authors: Ribeiro, Joana Jesus
Orientador: Gonçalves, António Freire
Santana, Maria Isabel Jacinto
Melo, Maria Joana Lima Barbosa
Keywords: Epilepsia fármaco-resistente; Metilação do DNA; Recetores GABAA; Sequenciação de nova geração; Variação número cópias; Copy number variation; DNA methylation; GABAA receptors; Next generation sequencing; Pharmacoresistant epilepsy
Issue Date: 23-Jun-2023
Serial title, monograph or event: Pharmacoresistant epilepsy focal: histopathological and molecular approach
Place of publication or event: Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Abstract: A epilepsia afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo uma das doenças neurológicas mais comuns. A cirurgia ressectiva da epilepsia é uma opção de tratamento comprovada em casos selecionados de epilepsia focal refratária à terapêutica, em crianças e adultos, apoiada por um crescente número de estudos. O diagnóstico histopatológico é essencial para a correlação clínica, a estratificação de resultados e a orientação do doente. Mesmo aplicando as recomendações internacionais para uma análise histopatológica padronizada das amostras pós-cirúrgicas, o amplo espectro de variantes morfológicas torna a classificação baseada apenas na análise histopatológica um desafio. A crescente disponibilidade de tecido cerebral humano patológico obtido durante a cirurgia da epilepsia, combinada com o progresso da tecnologia molecular, pode contribuir para uma melhoria na classificação histopatológica e no tratamento da epilepsia focal fármaco-resistente. Neste projeto utilizou-se uma abordagem molecular multidisciplinar para realizar uma análise abrangente em amostras de tecido cerebral patológico obtido na cirurgia de epilepsia, com foco nos diagnósticos histopatológicos mais frequentes (displasia cortical focal, tumores associados a epilepsia de longa duração e esclerose do hipocampo). Os principais objetivos deste estudo foram: compreender a base (cito)genómica da displasia cortical focal e dos tumores associados à epilepsia de longa duração; identificar padrões aberrantes de metilação do DNA em genes relevantes no tecido de tumores associados a epilepsia de longa duração; e analisar a fosforilação do recetor GABAA β3 na epilepsia do lobo temporal mesial com esclerose do hipocampo.Foram incluídos doentes, crianças e adultos, submetidos a cirurgia por epilepsia focal refratária à terapêutica, com diagnóstico histopatológico de displasia cortical focal (tipo I e II), de tumor associado a epilepsia de longa duração ou de esclerose do hipocampo. As amostras pós-cirúrgicas congeladas a fresco foram colhidas de acordo com as recomendações internacionais implementadas no Laboratório de Neuropatologia do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra. Foram aplicadas diferentes técnicas, como sequenciação completa do genoma nas displasias corticais focais, array-comparative genomic hybridization e methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification em tumores associados a epilepsia de longa duração, e análise de western blot na esclerose do hipocampo.A caracterização clínica do nosso conjunto de doentes submetidos a cirurgia ressectiva da epilepsia revelou que há ainda um intervalo de tempo considerável entre o início da epilepsia e a realização da cirurgia, e que a idade aquando da cirurgia tem vindo a aumentar nos últimos anos. Por outro lado, os principais diagnósticos histopatológicos encontrados apresentaram resultados cirúrgicos diferentes. Variantes germinativas (DEPDC5 p.Thr1081Pro) e somáticas (WDR24 p.Trp259Gly; MICAL1 p.Lys1036Arg; KATNB1 p.Leu566Ile; MATN4 p.Phe91Val; ANKRD6 p.His386Gln) foram identificadas em doentes com displasia cortical focal. A avaliação da patogenicidade destas variantes, com o seu consequente impacto na prática clínica, permanece um desafio. Em tumores associados a epilepsia de longa duração foram demonstradas alterações cromossómicas, incluindo monossomia do 19, deleção do 1p, deleções no 4p, 12p e 22q, e um ganho do 20p. As regiões alteradas comuns a vários doentes localizaram-se principalmente nos cromossomas 19 e 4p. Os genes MGMT e CD44 apresentaram alterações na metilação do DNA num subtipo de tumor associado a epilepsia de longa duração. Foi observada uma redução da fosforilação da subunidade β3 do recetor GABAA na epilepsia do lobo temporal mesial associada a esclerose do hipocampo, sugerindo um aumento da internalização dos recetores GABAA. Live imaging experiments usando neurónios do hipocampo de rato para o estudo da dinâmica da membrana sob condições epileptogénicas corroboraram as alterações no tráfego dos recetores GABAA.Em conclusão, este trabalho fornece dados relevantes sobre a cirurgia de epilepsia ao longo de mais de 20 anos de experiência, permitindo ilustrar as principais patologias estruturais e as tendências na orientação clínica ao longo do tempo. A colheita e o armazenamento de amostras frescas congeladas obtidas durante a cirurgia da epilepsia num laboratório de neuropatologia é essencial para a investigação translacional. Os dados obtidos nos estudos (epi)genéticos e na análise da fosforilação do recetor GABAA β3 em tecido humano pós-cirúrgico contribuíram para descodificar o panorama molecular e patológico da epilepsia focal. Os resultados genómicos podem levar à definição de novos biomarcadores diagnósticos, permitido dar um passo em frente para um diagnóstico histopatológico e molecular integrado. As alterações no tráfego dos recetores GABAA representam potenciais alvos para tratamentos experimentais na epilepsia refratária.
Epilepsy affects around 50 million people worldwide, making it one of the most common neurological diseases. Resective epilepsy surgery is an established treatment option for selected drug-resistant focal epilepsies, in children and adults, supported by an ever-growing number of studies. The histopathological diagnosis is essential for clinical correlation, outcome stratification, and patient management. Even with international recommendations for a standardized histopathological analysis of postsurgical specimens, the broad spectrum of morphological variants makes a histopathologically driven classification a challenge. The increasing availability of pathological human brain tissue obtained during epilepsy surgery combined with the progress in molecular technology may contribute to an improvement in histopathological classification and treatment of pharmacoresistant focal epilepsy. In this project we used a multidisciplinary molecular approach to perform a comprehensive analysis of pathological brain samples from epilepsy surgery, focusing on the most frequent histopathological diagnoses (focal cortical dysplasia, long-term epilepsy-associated tumors, and hippocampal sclerosis). The main aims of this study were: to understand the (cyto)genomic basis of focal cortical dysplasia and long-term epilepsy-associated tumors; to identify aberrant DNA methylation patterns in relevant genes in long-term epilepsy-associated tumors’ tissue; and analyze GABAA receptor β3 phosphorylation status in mesial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis.Patients with drug-resistant focal epilepsy, both children and adults, associated to histologically proven focal cortical dysplasia (type I and II), long-term epilepsy-associated tumor and hippocampal sclerosis, who underwent surgical treatment were included. Fresh frozen postsurgical brain samples were collected according to international recommendations, that were implemented in the Neuropathology Laboratory of Coimbra University Hospital Center. Different techniques were applied, such as whole genome sequencing in focal cortical dysplasias, array-comparative genomic hybridization and methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification in long-term epilepsy-associated tumors, and western blot analysis in hippocampal sclerosis.The characterization of our resective epilepsy surgical series unveiled that there is still a considerable delay between epilepsy onset and surgery, and that the age at surgery increased in the most recent years. Moreover, the main histopathological diagnoses presented different postsurgical outcomes. Germline (DEPDC5 p.Thr1081Pro) and somatic (WDR24 p.Trp259Gly; MICAL1 p.Lys1036Arg; KATNB1 p.Leu566Ile; MATN4 p.Phe91Val; ANKRD6 p.His386Gln) variants were identified in patients with focal cortical dysplasia. The pathogenicity assessment of these variants, with its consequent impact in clinical practice, remains a challenge. Chromosomal abnormalities were demonstrated in long-term epilepsy-associated tumors, including monosomy 19, deletion of 1p, deletions in 4p, 12p, and 22q, and a gain of 20p. The altered regions common to several patients were located mainly in the chromosomes 19 and 4p. The MGMT and CD44 genes presented alterations in DNA methylation in a subtype of long-term epilepsy-associated tumor. Reduced levels of GABAA receptor β3 subunit phosphorylation were observed in mesial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis, suggesting an increased internalization of GABAA receptors. Live imaging experiments using rat hippocampal neurons to study membrane dynamics under epileptogenic conditions supported GABAA receptors trafficking alterations.In conclusion, this work provides relevant data on epilepsy surgery practice over more than 20 years of experience, illustrating the main structural causes and the clinical trends over time. The collection and storage of fresh frozen specimens from epilepsy surgery as a routine in a neuropathology laboratory is essential for translational research. The data obtained from the (epi)genetic studies and from the GABAA receptor β3 phosphorylation status analysis in postsurgical human tissue contribute to decode the molecular and pathological framework of focal epilepsy. The genomic findings may lead to the definition of new diagnostic biomarkers, giving a step forward to an integrative histopathological and molecular diagnosis. GABAARs trafficking alterations represent potential targets to experimental treatments in drug-resistant epilepsy.
Description: Tese de Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde apresentada à Faculdade de Medicina
URI: https://hdl.handle.net/10316/114446
Rights: embargoedAccess
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