Mechanisms Underlying the Specification of Definitive Hematopoiesis

Abstract

Hematopoietic stem cells (HSCs) maintain blood through self-renewal and differentiation. Although HSC transplantation is the only cure for various blood disorders, generating and maintaining HSCs in vitro remains challenging, partly due to a limited understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying human HSC ontogeny. In embryos, definitive HSCs arise from hemogenic endothelium via an endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) in the aortagonad-mesonephros (AGM) region and placenta. In humans, limited access to embryos hinders the study of this process. Exploring new methods to mimic hematopoietic development in vitro may shed light on the regulators and mechanisms of human HSC specification in vivo. In my thesis, I outlined a protocol for generating hemogenic-like cells with hematopoietic potential from human dermal fibroblasts (HDFs) through direct cell reprogramming. HDFs were transduced with lentiviruses encoding GATA2, GFI1B, and FOS transcription factors (TFs). These three TFs activate hemogenic and hematopoietic transcriptional programs in HDFs, recapitulating EHT and leading to the generation of hematopoietic progeny capable of short-term engraftment in mice. Notably, I showed that the three TFs induce the expression of the HSC marker CD9 at early stages of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming offers a tractable platform for identifying new markers and regulators of human HSC development. I then combined hemogenic reprogramming with CRISPR/Cas9 knockout screening to identify regulators. I transduced HDFs with lentivirus encoding Cas9 and a single guide RNA library targeting over 100 genes related to HSC function. In parallel, I optimized the delivery of the three TFs in a single polycistronic vector at a defined stoichiometry, where high levels of GATA2 and GFI1B induced reprogramming efficiently. After Cas9-edited cells underwent hemogenic reprogramming, my colleagues and I isolated both successfully and unsuccessfully reprogrammed cells based on the expression of CD49f and CD9 for next-generation sequencing. Surprisingly, we identified two markers of hemogenic endothelium and HSCs, CD34 and CD44, as barriers to hemogenic reprogramming, while STAG2 was uncovered as a facilitator of the process. These results suggest that commitment to human hemogenic and hematopoietic identity may benefit from time-wise inhibition of CD34 and CD44 signaling. Finally, I set out to uncover a less appreciated role of TFs in vivo using definitive hematopoiesis as a model. Several TFs remain bound to chromatin during mitosis and mark specific genomic sites – a mechanism termed “mitotic bookmarking”. Mitotic retention and bookmarking have been associated with the maintenance of pluripotency, cell reprogramming, and the preservation of somatic lineages in vitro, but the relevance for lineage commitment in vivo remains to be addressed. Here, I assessed the mitotic retention of hemogenic reprogramming TFs using fluorescent fusion proteins and subcellular protein quantification. Live-cell imaging and western blotting showed that GATA2 remains bound to chromatin in mitosis via Cterminal zinc finger-mediated DNA binding, as opposed to GFI1B and FOS. Moreover, GATA2 bookmarks a subset of its interphase sites with a higher density of GATA2 motifs, which include key regulators of hematopoietic fate. To uncover the role of GATA2 at mitotic exit in vivo, we generated a mouse model with the mitosis-degradation domain of cyclin B1 inserted upstream the Gata2 gene. Remarkably, homozygous mice died during development, partially phenocopying Gata2 null mice, which die at the onset of definitive hematopoiesis. Interestingly, removing GATA2 at mitosis-to-G1 transition impacts AGM and placental hematopoiesis but not yolk sac hematopoiesis. Altogether, these findings implicate GATA2 as a mitotic bookmarker critical for definitive hematopoiesis and underscore a dependency on bookmarkers for in vivo lineage commitment. Overall, my thesis provides new insights on the molecular mechanisms underlying the specification of definitive hematopoiesis. In the future, harnessing these mechanisms may enable the faithful generation of patient-tailored HSCs to meet clinical demands.

As células estaminais hematopoiéticas têm a capacidade de se autorrenovarem e produzir sangue através de um processo de diferenciação. Embora o transplante de células estaminais hematopoiéticasseja a única cura para várias doenças sanguíneas, a produção e manutenção destas células in vitro continua a ser um desafio, em parte devido à escassez de conhecimento relativamente aos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na sua ontogenia no ser humano. No embrião, as células estaminais hematopoiéticas definitivas originam-se a partir de endotélio hemogénico, através de uma transição endotelial-hematopoiética, na aorta-gónadamesonefros e na placenta. No entanto, o acesso limitado a embriões dificulta o estudo deste processo no ser humano. O estudo de novos métodos para replicar o desenvolvimento hematopoiético in vitro pode ajudar a descobrir moléculas e mecanismos reguladores envolvidos na especificação das células estaminais hematopoiéticas humanas in vivo. Na minha tese, delineei um protocolo para gerar células com características semelhantes a células hemogénicas, com potencial hematopoiético, a partir de fibroblastos humanos, através da reprogramação direta de células. Os fibroblastos foram transduzidos com lentivírus que codificavam três fatores de transcrição: GATA2, GFI1B e FOS. Estes fatores foram anteriormente descritos como sendo suficientes para ativar programas de transcrição hemogénica e hematopoiética em fibroblastos, imitando a transição endotelial-hematopoiética e gerando progenitores hematopoiéticos capazes de enxertar murganhos a curto prazo. Para mais, demonstrei que os três fatores induzem a expressão do marcador de células estaminais hematopoiéticas CD9, o qual ainda não tinha sido associado à reprogramação hemogénica. Assim, a reprogramação hemogénica oferece uma plataforma viável para identificar novos marcadores e reguladores do desenvolvimento das células estaminais hematopoiéticas no ser humano. Consequentemente, combinei este sistema com um processo de triagem de genes, usando a tecnologia CRISPR/Cas9, de forma a definir genes reguladores da reprogramação hemogénica. Numa primeira instância, transduzi fibroblastos de origem humana com o lentivírus para a proteína Cas9 e uma biblioteca de “single guide RNA” direcionada a mais de 100 genes relacionados com a função das células estaminais hematopoiéticas. Em paralelo, otimizei a entrega dos três fatores num único vetor policistrónico numa estequiometria definida, em que níveis elevados de GATA2 e GFI1B induziram eficazmente a reprogramação. Após as células editadas com Cas9 passarem pelo processo de reprogramação, eu e os meus colegas isolámos células reprogramadas e não-reprogramadas, de acordo com os níveis de expressão de CD49f e CD9, que foram submetidas a um processo de sequenciação. Inesperadamente, identificámos as proteínas CD34 e CD44, que são dois marcadores importantes do endotélio hemogénico e das células estaminais hematopoiéticas, como barreiras para a reprogramação hemogénica, enquanto a proteína STAG2 foi apresentada como facilitadora do processo. Esses resultados sugerem que a especificação das linhagens hemogénicas e hematopoiéticas em humanos pode beneficiar da inibição das vias de sinalização controladas pelas proteínas transmembranares CD34 e CD44, em contraste com as funções previamente relatadas. Finalmente, propus-me a descobrir um papel menos valorizado dos fatores de transcrição in vivo, usando a hematopoiese definitiva como modelo. Atualmente sabe-se que vários fatores permanecem ligados à cromatina durante a mitose e marcam locais genómicos específicos - um mecanismo denominado "bookmarking" mitótico. A retenção mitótica e o "bookmarking" têm sido associados à manutenção da pluripotência, à reprogramação celular e à preservação de linhagens somáticas in vitro, mas a relevância para a especificação de linhagens celulares in vivo ainda não tinha sido abordada. Aqui, avaliei a retenção mitótica dos fatores de reprogramação hemogénica usando proteínas de fusão de fluorescência e quantificação de proteínas ao nível subcelular. As imagens de células não fixadas e análises de membranas de “western blot” mostraram que o GATA2 permanece ligado à cromatina durante a mitose através da ligação ao ADN mediada pelo domínio “zinc-finger” do Cterminal, ao contrário do GFI1B e do FOS. Além disso, o GATA2 marca um subgrupo de regiões genómicas no ADN, com um maior número de regiões de ligação ao GATA2, que incluem reguladores-chave da linhagem hematopoiética. De forma a descobrir o papel do GATA2 durante a saída mitótica in vivo, nós gerámos um modelo de murganho em que inserimos o domínio de degradação da mitose da ciclina B1 a montante do gene Gata2. Para nossa surpresa, os murganhos homozigóticos para o domínio de degradação morreram durante o desenvolvimento, copiando parcialmente o fenótipo dos murganhos sem Gata2, os quais morrem no início da hematopoiese definitiva. De notar que a deleção do GATA2 na transição mitose-G1 tem um impacto específico na hematopoiese da aorta-gónadamesonefros e da placenta, mas não na hematopoiese do saco vitelino. Ao todo, estes resultados implicam o GATA2 como um marcador mitótico crucial para a hematopoiese definitiva e destacam uma dependência de “bookmarkers” para o estabelecimento de linhagens celulares in vivo. Em resumo, a minha tese oferece novas perspetivas sobre os mecanismos subjacentes à especificação da hematopoiese definitiva. O conhecimento coletivo apresentado na minha tese pode, no futuro, possibilitar a produção fidedigna de células estaminais hematopoiéticas, a partir de células de pacientes, para atender às necessidades clínicas.