PAVING THE WAY FOR A PERSONALIZED MANAGEMENT OF BREAST CANCER: EXPLORING THE CROSSTALK BETWEEN THE TUMOR AND THE IMMUNE SYSTEM

Abstract

Introdução: Os gânglios linfáticos são a principal via de metastização e o seu estadiamento é um fator de prognóstico major. No cancro da mama (CM), o método OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification) está a ser adotado à escala global para o estadiamento dos gânglios sentinela (GS). Os lisados OSNA podem, adicionalmente, ser usados para estudos de expressão génica, sendo potencialmente as amostras ideais para a investigação de marcadores relacionados com a resposta imune. Através da avaliação da expressão génica nos GS, pretendemos identificar perfis transcritómicos de resposta imune, que poderão otimizar a estratificação de risco e o desenvolvimento de terapêuticas dirigidas em doentes com CM Luminal A. Material e métodos: Estudo piloto, da iniciativa do investigador, prospetivo e observacional. Foram incluídas doentes com CM Luminal A (cT1-T2 N0): 16 com GS OSNA negativos (pN0) e 16 com GS OSNA positivos, incluindo 7 com micrometástases (pN1mi) e 9 com macrometástases (pN1). Para cada doente procedeu-se à sequenciação de RNA do excedente do lisado OSNA da amostra com maior valor de citoqueratina 19 (CK19) utilizando o Oncomine™ Immune Response Research Assay, o qual inclui um painel de 395 genes envolvidos na interação tumor-microambiente. A análise estatística dos dados clínicos foi realizada com o software STATA, versão 13.1. A significância estatística foi estabelecida em p < 0.05. A identificação dos genes diferencialmente expressos (DEGs) foi realizada utilizando o DESeq2 R (versão 1.36.0) no R (versão 4.2.0), com valor-p ajustado < 0.05 e fold change de 1.5. Foi ainda realizada análise de componentes principais (PCA) e análise hierárquica de clusters com o Pheatmap R package. Resultados: Não se verificaram diferenças entre os grupos nas características clínicas nem nos linfócitos infiltrantes tumorais (TILs). Para cada doente, o resultado OSNA da amostra estudada e a carga tumoral total (TTL) foram praticamente coincidentes. Nos GS metastáticos, a TTL média foi 121 238.1 ± 213 294.7 (mínimo = 280; máximo = 730 000). A comparação entre GS pN1 e pN0 revelou 11 DEGs: KRT7, VTCN1, CD44, GATA3, ALOX15B, RORC, NECTIN2, LRG1, CD276, FOXM1 e IGF1R. Não se identificaram DEGs comparando GS pN1mi com GS pN0. Valores mais elevados de CK19 na amostra OSNA estudada e de TTL correlacionaram-se com maior expressão dos DEGs, com a exceção do ALOX15B. Também se verificaram correlações positivas entre o diâmetro do tumor e os níveis de expressão de KRT7, GATA3 e FOXM1; entre o grau tumoral e os níveis de expressão de KRT7, VTCN1, CD44, GATA3, RORC, NECTIN2, LRG1, CD276 e FOXM1; e entre os recetores de progesterona e os níveis de expressão de ALOX15B e NECTIN2. A PCA incluindo todos os genes foi sugestiva de um perfil de expressão génica similar entre os pN0 e os pNmi e identificou dois pN1 outliers. A análise hierárquica de clusters, utilizando os DEGs, estabeleceu três clusters: o cluster 1, correspondendo aos dois outliers identificados na PCA, teve os maiores níveis de expressão dos 11 DEGs e o maior número total de gânglios linfáticos (sentinela e não-sentinela) com metástases (5.0 ± 2.8), enquanto o cluster 3, com amostras predominantemente pN0 e pN1mi, teve os menores níveis de expressão dos 11 DEGs e o menor número total de gânglios linfáticos com metástases (0.3 ± 0.5). De realçar que a distribuição dos clusters não foi inteiramente coincidente com o estadiamento dos GS. Discussão: Os DEGs incluem genes expressos nas células de CM e nas células imunoinflamatórias. Nos GS metastáticos, valores mais elevados do resultado OSNA na amostra estudada e de TTL correlacionaram-se com maiores níveis de expressão da maioria dos DEGs, evidenciando a presença de células tumorais e, eventualmente, também a resposta do microambiente. Os 11 DEGs identificados codificam proteínas principalmente envolvidas na agressividade tumoral e com impacto na resposta imune. A identificação destes potenciais biomarcadores no lisado OSNA poderá ser determinante na otimização da estratificação de risco e para o desenvolvimento de terapêuticas dirigidas. A não identificação de DEGs que evidenciem uma ativação da resposta imune poderá estar relacionada com o aumento da expressão dos checkpoints imunológicos inibitórios VTCN1 e CD276. Por último, como a tecnologia OSNA tem sido utilizada noutros tipos de cancro, a sequenciação de RNA nos lisados OSNA poderá vir a ter uma utilidade mais abrangente. Conclusões: Foram identificados 11 DEGs envolvidos na interação tumor-microambiente. A análise hierárquica de clusters é sugestiva de que o perfil de expressão génica poderá acrescentar informação à atual avaliação dos GS. A assinatura genética dos GS tem potencial para estabelecer uma estratificação de prognóstico com maior precisão e para a implementação de tratamentos mais eficazes, dado que a complexa interação entre as células tumorais e o sistema imunitário emerge como um alvo promissor para futuras terapêuticas personalizadas.

Background: Lymph nodes (LNs) are the main doorway for tumor cell metastases from the primary site and its evaluation is a major prognostic factor. The One Step Nucleic Acid Amplification (OSNA) is being adopted worldwide for sentinel-LNs (SLNs) staging in breast cancer (BC). The SLNs´ OSNA lysate samples may be used for gene expression studies, being the potentially ideal samples to search for new markers related with immune response. Using a targeted gene expression approach, we aim to identify transcriptomic patterns of immune response, at the level of SLNs, that may improve risk stratification and development of targeted therapies for patients with Luminal A BC. Material and methods: We present an investigator’s initiative, observational, prospective, pilot study. Patients with Luminal A BC (cT1-T2 N0), 16 with OSNA negative SLNs (pN0) and 16 with OSNA positive SLNs, including 7 with micrometastases (pN1mi) and 9 with macrometastases (pN1), were enrolled. For each patient, the remaining OSNA lysate of the sample with higher values of cytokeratin 19 (CK19) was kept for RNA sequencing using Oncomine™ Immune Response Research Assay, a panel including 395 genes involved in the crosstalk between cancer and immune-related cells. The calculations regarding clinicopathological data were performed with the STATA software, version 13.1. Statistical significance was set at p < 0.05. Identification of differentially expressed genes (DEGs) for different group comparisons was performed by DESeq2 R package (version 1.36.0) in R (version 4.2.0) using an adjusted p-value (false discovery rate) threshold of 0.05 and a fold change cut-off of 1.5. Principal component analysis (PCA) and hierarchical clustering heatmaps were also performed (Pheatmap R package). Results: The clinical features of the two groups of patients were similar. Noteworthy, there were no statistically significant differences in the tumor infiltrating lymphocytes (TILs). For each patient, the OSNA sample result and the total tumor load (TTL) were almost coincident. In metastatic SLNs, the mean TTL was 121 238.1 ± 213 294.7 (minimum = 280; maximum = 730 000). Comparison between pN1 and pN0 SLNs revealed 11 upregulated DEGs: KRT7, VTCN1, CD44, GATA3, ALOX15B, RORC, NECTIN2, LRG1, CD276, FOXM1 and IGF1R. No DEGs were identified when comparing pN1mi and pN0 SLNs. Higher values of CK19 in the OSNA sample and of TTL were correlated with higher expression levels of DEGs, except for ALOX15B. There were also statistically significant positive correlations between tumor diameter and expression levels of KRT7, GATA3 and FOXM1; between tumor grade and expression levels of KRT7, VTCN1, CD44, GATA3, RORC, NECTIN2, LRG1, CD276 and FOXM1; and between progesterone receptors and expression levels of ALOX15B and NECTIN2. PCA including all genes suggested a similar gene expression profile between pN0 and pN1mi and identified two pN1 outliers. Lastly, hierarchical clustering analysis, using the DEGs, established three different clusters: cluster 1, corresponding to the two PCA outliers samples, had the highest gene expression levels of all the 11 DEGs and the highest total number of LNs (sentinel and non-sentinel) with metastases (5.0 ± 2.8), whereas cluster 3, enriched in pN0 and pN1mi samples, had the lowest gene expression levels of all the 11 DEGs and the lowest total number of LNs with metastases (0.3 ± 0.5). Noteworthy, cluster distribution was not entirely coincident with SLN staging. Discussion: The upregulated DEGs include genes mainly expressed in BC cells and genes also expressed in immunoinflammatory cells. In metastatic SLNs, higher levels of tumor load in the analyzed OSNA sample and of TTL were correlated with higher expression levels of the majority of the DEGs, reflecting the presence of cancer cells and eventually also microenvironment response. The 11 identified DEGs codify proteins mainly involved in cancer aggressiveness and with impact in immune response. The identification of these potential biomarkers may be crucial to improve risk stratification and to develop targeted therapies. The lack of evidence of the involvement of other genes associated with immune system activation could possibly be related to the increased expression of the inhibitory immune checkpoints VTCN1 and CD276. Lastly, as OSNA is being adopted worldwide not only in BC but also in other cancers, RNA sequencing on the OSNA lysate could have translational utility for other cancer types. Conclusions: Eleven DEGs involved in tumor-microenvironment interplay were identified. Hierarchical clustering analysis suggested that the expression profile of these genes may bring further information on current SLN evaluation. In the future, the SLNs’ gene-signature could be used for defining a more accurate prognosis and more effective treatments, as the complex interplay between cancer cells and host immunity emerges as a promising target to future personalized therapies.