Characterization of protein-protein interactions involving G-Protein-Coupled Receptor 143 by computational and pharmacological methods

Abstract

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) desempenham funções críticos no desenvolvimento e progressão de várias patologias. Muitos membros da família GPCR são expressados no cérebro e exercem suas funções por meio de neurotransmissores conhecidos, como dopamina, noradrenalina e outras moléculas. Eles também têm sido considerados determinantes estruturais e biológicos de doenças neurodegenerativas.Além do fato de que GPCRs individuais podem contribuir para condições patológicas por meio de desregulação ou ativação aberrante, agora é amplamente aceito que GPCRs são capazes de formar homo e heterodímeros funcionais, bem como oligômeros que consistem em mais de dois receptores. Crosstalk e interação, também denominadas interações proteína-proteína (PPIs), levam a mudanças nas vias de sinalização e resultados fisiológicos complexos. Esses PPIs também foram relatados como tendo um impacto significativo nos processos de doença.Neste estudo, foram investigados dois tipos de GPCRs, ambos provavelmente relevantes para condições neurológicas e consequentes patologias: receptor de dopamina D2 (D2R) e receptor acoplado à proteína G 143 (GPR143). Embora os receptores de dopamina, especialmente D2R, tenham sido correlacionados com muitas doenças neurológicas e neurodegenerativas, a tarefa preciso do órfão GPR143 ainda não foi descoberto.Determinamos um PPI relevante entre GPR143 e receptores de dopamina (DR), especialmente D2R e D3R, e mostramos que GPR143 modula negativamente a atividade de DR em resposta à dopamina. Ademais, fomos capazes de localizar complexos GPR143-DR em vesículas intracelulares. Este efeito não foi influenciado pela co-expressão de GPR143 de tipo selvagem, que geralmente não é encontrado na membrana plasmática, ou a variante GPR143 localizada na membrana plasmática, pmGPR143, foi co-expressa. Estudamos o efeito de GPR143 em DRs via recrutamento de β-arrestina e visualizamos os complexos usando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET).Em seguida, estudamos a homodimerização PPI do conhecido alvo D2R. Foi relatado que os homodímeros D2R estão envolvidos no desenvolvimento de esquizofrenia e estresse de derrota social. Construímos diferentes configurações de homodímeros D2R, onde os protômeros tinham conformações diferentes, por exemplo, ativo (ligado ao D2R-agonista bromocriptina), inativo e ligado a β-arrestina. Depois de construir uma pipeline computacional para gerar, pontuar e encaixar dímeros GPCR, os modelos de homodímeros D2R foram submetidos a simulações de dinâmica molecular. A partir dessas simulações, podemos concluir que os domínios transmembrana 4 e 5 (TM4 e TM5, respectivamente) são os mais proeminentes na interface do dímero. Ademais, identificamos um subconjunto de resíduos-chave que eram principalmente apolares em TM4 e TM5. Outros TMs, como TM2 e TM3, também são relevantes para certas combinações de monômeros D2R. Para algumas configurações, a conformação inativa de um protômero levaria a uma mudança da conformação ativa para inativa de seu receptor parceiro. Também observamos que a conformação β-arrestina apresentaria propriedades de um receptor ativo, mesmo na ausência de um agonista, quando complexado com outro receptor. Sugerimos que esse comportamento reflita uma mudança para outro meta-estado após a dimerização. Os resultados deste estudo computacional são consistentes com os dados experimentais.Ao todo, este estudo fornece informações profundas sobre a dimerização de GPCRs no contexto de problemas neurológicos. Conseguimos elucidar a arquitetura dos homodímeros D2R de uma perspectiva computacional. Além disso, determinamos a funções potencial do GPR143 na sinalização dopaminérgica usando PPIs determinados experimentalmente. Nossos resultados sobre a dimerização de GPCRs são promissores como novas oportunidades para o desenvolvimento futuro de medicamentos para doenças neurodegenerativas.

G protein-coupled receptors (GPCRs) play a critical role in the development and progression of various pathologies. Many members of the GPCR family are expressed in the brain and exert their functions through known neurotransmitters, such as dopamine and noradrenaline. They have also been considered structural and biological determinants of neurodegenerative diseases. Apart from the fact that single GPCRs can contribute to pathological conditions through dysregulation or aberrant activation, it is now widely accepted that GPCR can form functional homo- and heterodimers, as well as oligomers consisting of more than two receptors. Crosstalk and interaction, also termed protein-protein interactions (PPIs), lead to changes in signaling pathways and complex physiological outcomes. Such PPIs have also been reported to have a significant impact on disease progression. In this study, two types of GPCRs were investigated, both of which are probably relevant to neurological conditions and consequent pathologies: dopamine receptor D2 (D2R) and G protein-coupled receptor 143 (GPR143). While dopamine receptors, especially D2R, have been correlated with many neurological and neurodegenerative diseases, the precise role of orphan GPR143 is yet to be discovered. We determined a relevant PPI between GPR143 and dopamine receptors (DR), especially D2R and D3R, and showed that GPR143 negatively modulated DR activity in response to dopamine. Moreover, we were able to localize GPR143-DR-complexes in vesicles of the intracellular vesicles. This effect was not influenced by co-expression of wild-type GPR143, which is usually not found in the plasma membrane, or the plasma membrane-localized GPR143 variant pmGPR143. We studied the effect of GPR143 on DRs via β-arrestin recruitment and visualized the complexes using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Next, we studied PPI homodimerization of the well-known target D2R. D2R homodimers have been reported to be involved in the development of schizophrenia and social defeat stress. We constructed different setups of D2R homodimers, where the protomers had different conformations, such as active (bound to the D2R-agonist bromocriptine), inactive, and β-arrestin-bound. After constructing a computational pipeline for generating, scoring, and docking GPCR dimers, D2R homodimer models were subjected to molecular dynamics simulations. From these simulations, we can conclude that transmembrane domains 4 and 5 (TM4 and TM5, respectively) were the most prominent at the dimer interface. Furthermore, we identified a subset of key residues that were mostly non-polar in TM4 and TM5. Other TMs such as TM2 and TM3 are also relevant to certain combinations of D2R-monomers. In some setups, the inactive conformation of a protomer leads to a switch from the active to the inactive conformation of its partnered receptor. We also observed that the β-arrestin conformation would display the properties of an active receptor, even in the absence of an agonist, when complexed with another receptor. We suggest that this behavior reflects a switch to another meta-state upon dimerization. The findings of this computational study are consistent with the experimental data. Taken together, this study provides profound insights into GPCR dimerization in the context of neurological disorders. We elucidated the architecture of D2R homodimers from a computational perspective. Furthermore, we determined the potential role of GPR143 in dopaminergic signaling using experimentally determined PPIs. Our results on GPCR dimerization hold promise as novel opportunities for future drug development for neurodegenerative diseases.