Unravelling the Pivotal Role of Atropisomerism for Cellular Internalization

Abstract

O atropoisomerismo é uma fonte intrigante, mas muitas vezes negligenciada, de variabilidade biológica que pode ocorrer durante o desenvolvimento de fármacos. A avaliação individual de cada atropoisómero existente num fármaco pode revelar a presença de um isómero conformacional de maior eficácia. Contudo, o isomerismo conformacional é raramente tido em conta aquando o desenvolvimento de fotossensibilizadores, nomeadamente moléculas tetrapirrólicas, para terapia fotodinâmica (PDT). Os atropoisómeros do fotossensibilizador redaporfin são estáveis e possíveis de seres isolados. Estes apresentam efeitos fotodinâmicos muito diferentes, os quais resultam de níveis de internalização celular muito distintos. Os atropoisómeros da redaporfin são internalizados pelas células essencialmente por difusão passiva. No atropoisómero α4, a presença de todos os grupos sulfonamida no mesmo lado do macrociclo tetrapirrólico aumenta a interação deste confórmore com a bicamada lipídica das membranas celulares, o que facilita a subsequente difusão. Estudos in vivo também confirmaram que o atropoisómero α4 é o atropoisómero mais internalizado pelas células do ambiente micro-tumoral. Esta melhoria na internalização celular está correlacionada com uma maior eficácia da PDT em protocolos em que a iluminação dos tumores ocorre 24 h após a administração do fotossensibilizador.A internalização celular aparenta ser beneficiada quando todos os grupos polares da redaporfin estão orientados para o mesmo lado do macrociclo. Esta informação pode ser aproveitado para o desenvolvimento de novos fármacos com conformações que permitam uma internalização celular mais eficiente. A validação desta hipótese foi confirmada pela preparação de novas porfirinas com “presilhas” altamente restritivas que forçaram a configuração do atropisomer α4, pelo menos no que diz respeito à posição dos grupos polares. Métodos diretos de condensação entre os grupos pirrole e dialdeído permitiram a obtenção de isómeros de porfirinas, os quais foram caracterizados por cristalografia e 1H NMR. O isómero cis-αα, o qual exibe uma conformação análoga ao atropisomer α4, apresentou níveis de internalização celular mais elevados do que os outros isómeros. A validação desta estratégia com fotossensibilizadores de elevado peso molecular (>1000 Da) demonstra que as conclusões deste trabalho podem contribuir para o desenvolvimento de macromoléculas com uma internalização celular mais eficiente.

Atropisomerism presents an intriguing, often neglected, source of varied biological activity in drug development. For a stable atropisomeric drug mixture, assessment of individual atropisomers may reveal an individual isomer with higher efficacy. Tetrapyrrole isomerism is rarely considered during photosensitizer (PS) development for photodynamic therapy (PDT). The atropisomers of a pre-clinical bacteriochlorin PS for PDT, redaporfin, are stable and separable. They displayed vastly different photodynamic efficacy profiles, which were discovered to be a consequence of differential cellular uptake. Redaporfin atropisomer uptake was determined as a predominantly passive process in vitro. The α4 atropisomer, which features sulfonamide substituents orientated on the same side of the tetrapyrrole macrocycle, appeared to enhance binding interaction with the cell membrane phospholipid bilayer and subsequent diffusion. Cells of the tumor microenvironment exhibited enhanced α4 uptake in vivo which was correlated to the PDT efficacy when tumor illumination was performed 24 h after α4 administration. Orientation of polar groups to one side of the macrocycle plane appeared to benefit cell uptake in a manner which may be incorporated into drug design as an efficient cell-penetrating conformation. The validation of these findings was confirmed with the preparation of novel porphyrin photosensitizers with highly restrictive strap moieties to enforce the α4 configuration of polar groups. Direct condensation methods, between pyrrole and dialdehyde, yielded multiple double strapped porphyrin isomers which were characterized by single crystal X-ray crystallography and 1H NMR. Enhanced uptake of the cis-αα isomer, analogous in structure to the redaporfin α4 configuration, illustrated the potential of this motif to promote internalization. The success of this strategy with high molecular weight photosensitizers (> 1000 Da) demonstrates its potential for incorporation in the design of macromolecules to aid membrane passage.