Bioengineered Approaches for Studying and Treating Cardiac Disease or Ageing

Abstract

Cardiovascular diseases, and in particular ischemic heart disease, are the main cause of death worldwide. One of the main hallmarks of ischemic heart disease is acute myocardial infarction (MI), which comprises one of the main causes of disability and death. Although standard clinical treatments for MI decrease mortality, they are less efficient in preventing adverse cardiac remodelling. To solve this, innovative bioengineered therapeutic strategies for MI have been explored, showing to prevent adverse left ventricle (LV) tissue remodelling and improve heart function. However, few investigated new strategies to specifically improve electrical functional recovery. In this thesis, we studied the safety and therapeutic potential of a cell-free electroactive piezoelectric patch (Piezo patch) in the context of MI. The Piezo patch, which can generate electric charges upon mechanical deformation, showed a safety implantation profile by not affecting the electrophysiological function of healthy and ischemic rat hearts ex vivo and by slightly improving the contractility of healthy rat cardiac slices. Epicardial implantation of the Piezo patch for thirty days in an in vivo mouse model of MI significantly improved myocardial electrical integrity without disturbing LV systolic function. Furthermore, the Piezo patch treatment partially prevented ischemia-related adverse cardiac remodelling, reducing LV chamber dilatation and compensatory hypertrophy. Interestingly, Piezo patch-implanted hearts revealed a downregulation of genes associated with extracellular matrix remodelling and mitochondrial biogenesis. Notably, in vivo implantation of the Piezo patch in healthy or ischemic porcine hearts revealed to be electrically safe as no relevant effects in its electrophysiology were detected. Finally, it was shown that Piezo patches with clinically relevant dimensions could be implanted in a cardiac porcine model. To our knowledge, this is the first study evaluating the therapeutic potential of piezoelectric cardiac patches and it shows promising results that can inspire the design of future clinical therapeutic strategies for MI by improving structural and electrical remodelling.Although ageing is one of the main risk factors for cardiovascular diseases and there is an increasing ageing population, there is still limited information on the molecular alterations that occur in the aged human cardiomyocytes (CMs). In the present thesis, we have also explored the use of an in vitro model of LV human CMs to study the effects of ageing and potential therapeutic strategies by resorting to a heart-affecting premature ageing disorder, the Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS). HGPS is a fatal genetic disorder that causes premature children ageing that die usually of MI, heart failure or stroke. Even though HGPS causes cardiac alterations that partially resemble physiological/chronological ageing, little is known about the underlying mechanisms in CMs. By using CMs differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from HGPS-affected human individuals we: i) developed an in vitro model of human HGPS LV CMs (HGPS-iPSC-CMs); ii) studied the effects of HGPS (and potentially of physiological ageing) and underlying mechanisms in CMs; and iii) explored potential therapeutic strategies by assessing the effect of drugs previously related with HGPS treatment and/or cellular senescence. Single-cell transcriptomics revealed evidence that, when compared to a genome-corrected isogenic control line, HGPS-iPSC-CMs had an enrichment in the expression of maturation and hypertrophy-related genes. In addition, these cells showed alterations in mitochondrial respiration and calcium handling, exhibited a senescent phenotype and presented proteome changes. Rapamycin, a compound used in the context of both HGPS and physiological ageing, was the drug that more broadly reverted the HGPS-iPSC-CM phenotype, in terms of mitochondrial respiration, calcium handling, and cellular senescence. Lonafarnib, the only clinically approved compound for the treatment of HGPS, exhibited less clear improvements regarding the HGPS metabolic/functional phenotype and its senescent phenotype, when compared with rapamycin. To our knowledge, our HGPS-iPSC-CMs is the first in vitro model of human HGPS LV CMs and has the potential to open new research avenues on molecular mechanisms, biomarkers, and therapeutic targets associated with cardiac ageing in the context of HGPS and/or physiological ageing.In summary, this thesis unveils new perspectives on treatment strategies for two distinct heart-affecting conditions and on the in vitro modeling of human aged LV CMs.

As doenças cardiovasculares, e em particular a doença isquémica cardíaca, são a principal causa de morte a nível global. Uma das principais características da doença isquémica cardíaca é a ocorrência do enfarte agudo do miocárdio (MI), que constitui uma das principais causas de invalidez e morte. Os tratamentos clínicos convencionais para MI diminuem o número de mortes a si associados, no entanto são menos eficientes em prevenir uma remodelação cardíaca adversa. Assim, estratégias terapêuticas inovadoras de bioengenharia têm sido exploradas, sendo capazes de prevenir a remodelação adversa do tecido do ventrículo esquerdo (LV) e de melhorar a sua função. No entanto, poucos investigaram estratégias para melhorar especificamente a função elétrica. Nesta tese estudámos a segurança de implantação e o potencial terapêutico de um emplastro cardíaco piezoelétrico livre de células (Piezo patch) no miocárdio. O Piezo patch, capaz de gerar cargas elétricas após ser deformado mecanicamente, melhorou a contractilidade de fatias cardíacas de rato saudáveis e mostrou ter um perfil de implantação seguro visto que não provocou nenhum impacto mensurável na função eletrofisiológica em corações de rato saudáveis ou isquémicos num modelo ex vivo de coração em modo de execução de trabalho. A implantação do Piezo patch por trinta dias no epicárdio de um modelo in vivo de MI em murganho melhorou significativamente a integridade elétrica do miocárdio sem perturbar a função sistólica do LV. Além disso, o tratamento com o Piezo patch preveniu parcialmente a remodelação cardíaca, reduzindo a dilatação da câmara do LV e a hipertrofia. Curiosamente, os corações implantados com o Piezo patch mostraram uma redução na expressão de genes associados à remodelação da matriz extracelular e à biogénese mitocondrial. A implantação in vivo do Piezo patch em corações de porco saudáveis ou isquémicos revelou-se segura, tendo em conta que não se detetaram efeitos relevantes na sua eletrofisiologia. Por fim, mostrou-se que uma versão do Piezo patch com dimensões superiores e mais clinicamente relevantes foi implantado com sucesso nesse modelo. Pelo que sabemos, este é o primeiro estudo que avalia o potencial terapêutico cardíaco em emplastros cardíacos piezoelétricos e releva resultados promissores que podem inspirar novas estratégias de terapia clínica para o MI.Apesar do envelhecimento ser um dos principais fatores de risco para a ocorrência de doenças cardiovasculares e da população envelhecida estar a aumentar, a informação disponível sobre as alterações moleculares que ocorrem em cardiomiócitos (CMs) humanos envelhecidos é limitada. Nesta tese, explorámos também o uso de um modelo in vitro de CMs humanos de LV para estudar os efeitos do envelhecimento e potenciais estratégias terapêuticas recorrendo a uma doença de envelhecimento precoce – o síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS). HGPS é uma doença genética fatal que causa envelhecimento precoce nas crianças afetadas, cuja morte é geralmente causada por MI, insuficiência cardíaca, ou acidente vascular cerebral. O HGPS causa alterações cardíacas que se assemelham às do envelhecimento cardíaco fisiológico, mas pouco se sabe sobre os seus mecanismos subjacentes em CMs. Recorrendo a CMs diferenciados de células estaminais pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) derivadas de indivíduos afetados por HGPS: i) desenvolvemos um modelo in vitro de CMs humanos de LV de HGPS (HGPS-iPSC-CMs); ii) estudámos os efeitos do HGPS e mecanismos subjacentes em CMs; e iii) explorámos potenciais estratégias terapêuticas avaliando o efeito do tratamento crónico com compostos que estão relacionados com o tratamento do HGPS e/ou de senescência. Uma análise transcriptómica de células individuais mostrou indícios que, em comparação com um linha controlo isogénica com o genoma corrigido, as HGPS-iPSC-CMs mostraram um enriquecimento na expressão de genes relacionados com maturação e hipertrofia. Estas células mostraram alterações na respiração mitocondrial e gestão de cálcio, exibiram um fenótipo senescente, e apresentaram alterações no proteoma. A rapamicina foi o fármaco que reverteu de forma mais abrangente o fenótipo dos HGPS-iPSC-CMs, em termos de respiração mitocondrial, gestão de cálcio e senescência celular. O lonafarnib, o único composto clinicamente aprovado para o tratamento do HGPS, exibiu melhoramentos menos claros em termos de fenótipo HGPS, em comparação com a rapamicina. Os HGPS-iPSC-CMs representam o primeiro modelo in vitro de CMs de LV humanos de HGPS e possuem potencial para criar novas linhas de investigação sobre mecanismos moleculares, biomarcadores e alvos terapêuticos associados ao envelhecimento cardíaco no contexto do HGPS e/ou do envelhecimento fisiológico.Em suma, esta tese revela novas perspetivas ao nível de estratégias terapêuticas para duas patologias distintas que afetam o coração, e ao nível da modelação in vitro de CMs humanos de LV envelhecidos.