Novel spiro-lactams as new antimicrobial agents

Abstract

O trabalho apresentado nesta tese de Doutoramento teve como principal objetivo a síntese de novos espiropenicilanatos quirais com atividade antimicrobiana contra o HIV e o Plasmodium. Este objetivo foi alcançado tirando partido da reatividade dos 6-alquilidenopenicilanatos em reações de cicloadição [3+2] formal e em reações de cicloadição 1,3-dipolar.Estudos anteriores identificaram uma molécula, BSS-730A, com uma notável atividade submicromolar contra variadas estirpes de HIV-1 e HIV-2, incluindo estirpes multirresistentes, e contra ambos os estágios hepáticos e eritrocíticos da infeção por Plasmodium. Assim, o BSS-730A foi selecionado como molécula-líder para a modulação estrutural das novas espirociclopenteno-β-lactamas. Esta estratégia consistiu na síntese de doze novos 6-alquilidenopenicilanatos que participaram em reações de cicloadição [3+2] formal com alenoatos catalisadas por fosfina dando origem a trinta e oito novas espirociclopenteno-β-lactamas quirais. Estas reações permitiram a modulação estrutural da posição 1’, assim como uma modulação simultânea das posições 1’ e 2’. Nesta biblioteca de novas espirociclopenteno-β-lactamas, foi possível identificar seis compostos altamente ativos contra o HIV-1 e o HIV-2 numa escala nanomolar (e.g. IC50 HIV-1 < 0.050 μM), com quatro destes novos derivados a apresentarem atividade micromolar contra o Plasmodium. Foram ainda realizados estudos adicionais com o objetivo de investigar a interação de algumas espiro-β-lactamas com a BSA.Foram desenvolvidas duas rotas sintéticas sem precedentes com o objetivo de realizar modelações estruturais no anel espirocíclico. Primeiro, foi explorada a cicloadição 1,3-dipolar de 6-alquilidenopenicilanatos com nitronas, como via para a síntese de novas espiro-isoxazolidinas-β-lactamas quirais. Este processo foi estéreo- e diastereoseletivo, e envolveu a criação de três novos centros quirais. A síntese destes novos derivados resultou na identificação de duas novas espiro-β-lactamas com atividade antiviral moderada contra o HIV-1. Em seguida, a reatividade dos 6-alquilidenopenicilanatos com óxidos de nitrilo também foi explorada como estratégia para a síntese de novas espiro-isoxazolinas-β-lactamas quirais. Os produtos maioritários desta cicloadição resultam de uma adição estereosseletiva do dipolo à face com menos impedimento estéreo dos 6-alquilidenopenicilanatos (face-α), e do ataque do oxigénio da espécie dipolar ao carbono terminal da ligação dupla exocíclica. A síntese estéreo- e regioseletiva destes novos derivados foi conseguida tirando partido de três metodologias experimentais distintas: aquecimento convencional, irradiação por microondas e síntese em fluxo continuo.Por fim, foi descrita a primeira síntese de alquilideno-γ-lactamas fundidas a um anel de tiazolidina. A subsequente avaliação in vitro das propriedades anticancerígenas das alquilideno-γ-lactamas assim como das alquilideno-β-lactamas, permitiu identificar quatro compostos com valores de IC50 inferiores a 10 μM em células do melanoma humano (A375), e três compostos com valores de IC50 inferiores a 10 μM em células do carcinoma esofágico humano (OE19). Também são descritos estudos adicionais visando compreender o efeito dos compostos mais promissores nos mecanismos de morte celular, geração de espécies reativas de oxigénio, assim como na avaliação da sua habilidade para atuarem como inibidores de MMP-9.Em suma, o trabalho desenvolvido no âmbito desta tese de Doutoramento levou à síntese de novas famílias de espiro-β-lactamas quirais. Esta biblioteca extensiva de novas espiro-β-lactamas, permitiu a identificação de um conjunto de moléculas com notável atividade in vitro contra o HIV e o Plasmodium.

The main objective of this PhD thesis was the synthesis of new chiral spiropenicillanates with antimicrobial activity against HIV and Plasmodium. This goal was achieved by taking advantage of the reactivity of 6-alkylidenepenicillanates in annulation reactions and in 1,3-dipolar cycloaddition reactions.Prior bioactivity studies identified a molecule, BSS-730A, with remarkable submicromolar activity against multiple strains of HIV-1 and HIV-2, including multidrug resistant strains, and against both hepatic and erythrocytic stages of Plasmodium infection. BSS-730A was selected as lead molecule for the rational structural modulation of the novel spirocyclopentene-β-lactams. This strategy involved the synthesis of twelve novel 6-alkylidenepenicillanates, followed by phosphine-catalyzed [3+2] annulation reactions of the newly synthesized 6-alkylidenepenicillanates with allenoates, which resulted in the synthesis of thirty-eight novel chiral spirocyclopentene-β-lactams. These annulation reactions allowed the structural modulation of position 1’, and a simultaneous modulation of both positions 1’ and 2’. In this library of novel spirocyclopentene-β-lactams, it was possible to identify six compounds highly active against HIV-1 and HIV-2 in a nanomolar order (e.g. IC50 HIV-1 < 0.050 μM), with four of them displaying micromolar antiplasmodial activity. Further studies were carried out in order to investigate the interaction between some spiro-β-lactams and BSA. Concerning the structural modulation of the spirocyclic ring system, two unprecedented synthetic routes were developed. First, we explored the 1,3-dipolar cycloaddition of 6-alkylidenepenicillanates with nitrones, as a route to the synthesis of novel chiral spiroisoxazolidine-β-lactams incorporating the penicillanate nucleus under mild conditions. This process was stereo- and diastereoselective and involved the creation of three new chiral centers. The synthesis of these novel derivatives has resulted in the identification of two new spiro-β-lactams with moderate antiviral activity against HIV-1. The reactivity of 6-alkylidenepenicillanates with nitrile oxides was also explored as a strategy for the synthesis of novel chiral spiroisoxazoline-β-lactams. The major spiro[isoxazoline-4’,6-penicillanates] result from the addition of the dipole to the less sterically hindered α-side of the 6-alkylidenepenicillanate and the attack of the dipole’s oxygen to the terminal carbon of the exocyclic double bond of the 6-alkylidenepenicillanate. The stereo- and regioselective synthesis of these novel derivatives was achieved employing three different methodologies: conventional heating, microwave irradiation and continuous flow. Finally, the synthesis of the first chiral alkylidene-γ-lactams fused to a thiazolidine ring is described. Subsequent in vitro evaluation of the anticancer properties of alkylidene-γ-lactams and alkylidene-β-lactams allowed the identification of four compounds with IC50 values below 10 μM in A375 human melanoma cells, and three compounds with IC50 values below 10 μM in OE19 human esophageal carcinoma cells. Further studies aiming to get insight into the effect of the most promising compounds on cell death mechanism, reactive oxygen species generation as well as the evaluation of their ability to act as MMP-9 inhibitors were also unveiled.In summary, the work developed during this PhD thesis led to the synthesis of novel families of spiro-β-lactams. This extensive library of new chiral spiro-β-lactams enabled the identification of a set of molecules with remarkable in vitro activity against HIV and Plasmodium.