Algae and cyanobacteria biodeterioration within the UNESCO World Heritage site ‘University of Coimbra – Alta and Sofia’: Assessment of natural biocides as novel control strategies

Abstract

As microalgas e cianobactérias são consideradas colonizadores primários de monumentos rochosos, sendo capazes de causar alterações estéticas e físico-químicas nestes substratos. Assim, de modo a tentar evitar estes fenómenos de biodeterioração, os últimos anos têm sido caracterizados por um significativo aumento na procura de métodos e produtos alternativos aos biocidas convencionais.O trabalho apresentado nesta tese de doutoramento teve como objectivos entender o papel das microalgas e cianobactérias na biodeterioração dos monumentos rochosos pertencentes ao Património Mundial da UNESCO ‘Universidade de Coimbra – Alta e Sofia’, bem como, investigar novas estratégias para prevenir e controlar a proliferação destes organismos, através do uso de compostos naturais. Assim, o primeiro passo consistiu na caracterização das comunidades fotoautotróficas presentes nas paredes de calcário dolomítico da Sé Velha de Coimbra, através da implementação de técnicas dependentes de cultivo em conjunto com técnicas de Sequenciação de Próxima Geração. As técnicas dependentes de cultivo levaram à identificação de microalgas pertencentes às ordens Prasiolales, Chlorellales, Watanabea, Chlamydomonadales e Sphaeropleales, e de cianobactérias pertencentes às ordens Nostocales e Synechococcales. Complementarmente, as técnicas independentes de cultivo resultaram na identificação de populações pertencentes aos filos Chlorophyta, Cyanobacteria, Rhodophyta e Bacillariophyta. Este estudo também permitiu entender os padrões de distribuição das comunidades fotoautotróficas pelos diferentes biofilmes encontrados nas paredes da Sé Velha, bem como inferir sobre as suas especificações ecológicas. O uso de técnicas dependentes de cultivo revelou ser de extrema importância, pois permitiu isolar três cianobactérias novas para a ciência. Estes novos taxa foram estudados e caracterizados através de métodos polifásicos, o que resultou na descrição de uma nova espécie de Myxacorys (M. almedinensis sp. nov.) pertencente à ordem Synechococcales, um novo género e espécie da ordem Nostocales (Parakomarekiella sesnandensis gen. et. sp. nov.), e uma família, um género e uma espécie pertencentes à ordem Synechoccocales (Petrachlorosaceae fam. nov., Petrachloros gen. nov., Petrachloros mirabilis sp. nov.). Para além destas descrições, os genomas de cada uma destas novas cianobactérias foi também sequenciado, o que irá permitir futuramente o seu estudo e exploração mais profunda. No decorrer desta tese, as comunidades fotoautotróficas presentes nas paredes de algumas celas do Criptopórtico Romano do Museu Nacional Machado de Castro foram também estudadas através de técnicas dependentes e independentes de cultivo. Apesar de o Criptopórtico Romano ser considerado um ambiente indoor, verificou-se que algumas microalgas e cianobactérias identificadas nesse local foram também identificadas na Sé Velha de Coimbra (ambiente outdoor/semi-aberto). Estes resultados permitiram criar as hipóteses de que as condições geográficas, a curta distância entre os dois monumentos, a presença de pequenas aberturas para o exterior no Criptopórtico Romano, assim como a presença de turistas em ambos os monumentos e o tipo de rocha, possam ter tido um papel importante na dispersão de algumas destas espécies. O isolamento e identificação das espécies fototróficas da Sé Velha de Coimbra levou a que se prosseguissem e aprofundassem os trabalhos desta tese, levando ao estudo da bioreceptividade do calcário dolomítico face a estas mesmas espécies, em condições controladas de laboratório, usando culturas individuais vs mistas. Os resultados demonstraram que as réplicas de calcário dolomítico foram bioreceptivas a ambas as condições (culturas individuais vs mistas), e que os biofilmes mais desenvolvidos nas réplicas rochosas estavam associados a inóculos com culturas individuais. O estudo da bioreceptividade também permitiu entender alguns mecanismos de biodeterioração induzidos por algumas espécies, nomeadamente a capacidade para colonização endolítica e a formação de pequenas cavidades nas réplicas rochosas. Por fim, de modo a tentar controlar e prevenir a proliferação de organismos fotoautotróficos em superfícies rochosas, foram testados alguns compostos naturais derivados de algas marinhas. Contudo, apenas os extractos de carragenana pertencentes ao gametófito feminino da macroalga vermelha Chondracanthus teedei var. lusitanicus revelaram ser eficazes, conseguindo reduzir drasticamente a proliferação da cianobactéria Parakomarekiella sesnandensis em blocos rochosos, em condições controladas de laboratório. Estes resultados contribuíram para renovar o conhecimento actual das comunidades fotoautotróficas pertencentes aos monumentos da zona UNESCO de Coimbra, bem como entender os seus potenciais mecanismos de biodeterioração, e quais os compostos naturais poderão, ou não, ser utilizados no futuro para controlar a proliferação destes organismos em superfícies rochosas.

Microalgae and cyanobacteria are considered the primary colonizers of stone monuments, being able to cause severe aesthetic and physico-chemical alterations to these substrates. Given the major threat that these organisms pose to stone artworks, the past years have been characterized by an incredible rising search to find methods and products alternative to conventional biocides, in order to control the proliferation of these organisms.The work presented in this thesis aimed to understand the role of microalgae and cyanobacteria on the biodeterioration of stone monuments that make part of the UNESCO World Heritage site of the ‘University of Coimbra – Alta and Sofia’, and to investigate new control strategies by using natural compounds to prevent their proliferation and further cultural heritage loss. For this purpose, the first step consisted in the characterization of the phototrophic communities that were present at the limestone walls of the Old Cathedral of Coimbra, through the implementation of traditional cultivation techniques together with next-generation sequencing techniques. From this first analysis, culture-dependent approaches resulted on the identification of green microalgae belonging to Prasiolales, Chlorellales, Watanabea, Chlamydomonadales and Sphaeropleales, and cyanobacteria belonging to Nostocales and Synechococcales. Complementarily, culture-independent analysis revealed the presence of populations within phyla Chlorophyta, Cyanobacteria, Rhodophyta and Bacillariophyta. In addition, this study also allowed to understand the distribution patterns of the phototrophic communities among the distinct biofilms found at this site, as well as their ecological specifications. The use of traditional cultivation techniques applied in this first study revealed to be of major importance, as it allowed the isolation of three novel cyanobacteria taxa. These novel cyanobacterial taxa were then characterized through a polyphasic approach, which resulted in the description of a new Myxacorys species (M. almedinensis sp. nov.) within the Synechococcales, a new genus and species (Parakomarekiella sesnandensis gen. et sp. nov.) within the Nostocales, and a new family, a new genus and a new species within the Synechococcales (Petrachlorosaceae fam. nov., Petrachloros gen. nov. and Petrachloros mirabilis sp. nov.). Besides these descriptions, the genomes of these novel taxa were also sequenced, which will allow their further study and exploration. During the course of this thesis, the phototrophic communities that inhabit the limestone walls of the Roman Cryptoporticus of the National Museum Machado de Castro were also characterized through culture-dependent and -independent analyses. Interestingly, although being considered an indoor environment, some green microalgae and cyanobacteria species isolated and identified at this site have also been found at the Old Cathedral of Coimbra, which is considered an outdoor environment. These results allowed to hypothesize that the geographical conditions, the short distance between both monuments, the presence of small and narrow openings to the outside of the Roman Cryptoporticus, as well as the presence of tourist visits in both monuments and the nature of the lithotype (both limestone monuments), could have played an important role in the dispersal of some of these species. The isolation and identification of the phototrophic species from the Old Cathedral of Coimbra allowed to conduct a laboratory-based limestone bioreceptivity study, using single vs artificial multispecies phototrophic cultures. Results showed that the limestone blocks were bioreceptive to both phototrophic conditions (single vs artificial multispecies), and that the phototrophic biofilms were more developed in the presence of single species, rather than multispecies. The bioreceptivity study also allowed to understand some biodeterioration mechanisms induced by some species, namely the capacity for endolithic colonization and the formation of small cavities in the stone blocks. Lastly, as the main goal was to develop natural compounds to control and prevent the proliferation of phototrophic organisms in stone artworks, some seaweed-derived extracts were tested. However, only the carrageenan extract from the female gametophyte life cycle of the red seaweed Chondracanthus teedei var. lusitanicus revealed to be effective, drastically reducing the proliferation of the cyanobacterium Parakomarekiella sesnandensis in limestone blocks, under laboratory conditions. The scientific data gathered during the course of this thesis contributed to updating the current knowledge of the phototrophic communities that inhabit some UNESCO monuments in Coimbra, their potential biodeterioration mechanisms and which natural compounds could help (or not) control their proliferation on stone surfaces.