Gene editing technologies to Machado-Joseph disease

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD), or spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is the most common autosomal dominantly inherited ataxia worldwide. This neurodegenerative disorder is one of the nine known polyglutamine (polyQ) diseases associated with an expanded CAG repeat tract located in exon 10 of the human ataxin-3 (ATXN3) gene. An over-repetition of this triplet above a threshold of approximately 61 repeats, translates into an aberrantly elongated ATXN3 protein bearing an expanded polyQ sequence. The mutant protein acquires toxic properties, triggering multiple pathogenic events that elicit neuronal dysfunction and degeneration in specific brain regions, such as the cerebellum, brainstem and striatum. So far, MJD/SCA3 remains incurable, and since there is still no available therapy to delay or block disease progression, clinical management is limited to symptomatic relief and rehabilitating treatments. Nonetheless, a stunning progress has been made on the development of promising therapeutic approaches for this disease. Considering the toxic gain-of-function acquired by expanded ATXN3 species, strategies aiming at blocking the protein production in affected brain regions, using either RNA interference or antisense oligonucleotides, have shown encouraging results in models of the disease. Although limiting the disease progression, these strategies targeting the messenger RNA may produce an incomplete and/or transient therapeutic effect in target cells or tissues and may fail to achieve a disease cure. By acting at the DNA level, genome editing technologies, on the other hand, have been successfully used to permanently inactivate or correct disease-related genes, holding promise for the development of a definitive cure for inherited diseases, such as MJD/SCA3. Therefore, the aim of this project was to characterize the CAG repeat tract and flanking polymorphisms in MJD/SCA3 patients and to develop new potential therapeutic strategies based on genome editing technologies, counteracting MJD/SCA3 pathogenesis through two possible approaches: i) the permanent inactivation of the human ATXN3 gene or ii) the deletion of the CAG-containing region of the gene. In the first part of this project, described in chapter 2, a protocol to overcome technical difficulties related with the molecular characterization of the CAG motif and intragenic polymorphisms in MJD/SCA3 was developed. A single pair of primers was designed and validated, and two complementary PCR-based methods were established. In method I, PCR amplicons were cloned and sequenced, allowing the assessment of three single nucleotide polymorphisms in the vicinity of the CAG repeat (C987GG/G987GG, TAA1118/TAC1118 and C1178/A1178), which can constitute potential targets for personalized gene-based therapies. Method II combines PCR, capillary electrophoresis and a size correction formula, enabling a time and cost-effective determination of the number of CAGs. In chapter 3, transcription activator-like effector nucleases (TALENs) were used to permanently inactivate the gene implicated in MJD/SCA3. The ability of TALENs to promote ATXN3 gene editing was demonstrated both in vitro and in vivo models of the disease. An efficient diminishment of ATXN3 protein levels was also achieved in a lentiviral-based mouse of MJD/SCA3 upon stereotaxic injection of viral vectors encoding for TALEN sequences. However, despite the efficacy of ATXN3 gene silencing, increased neuronal dysfunction and neuroinflammation was observed in treated hemispheres, indicating the lack of tolerability of this strategy. In chapter 4, the therapeutic potential of the clustered regularly-interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas9 system was evaluated in the context of MJD/SCA3. Two mechanisms of action were explored in parallel: i) the permanent inactivation of the ATXN3 gene and ii) the excision of the CAG repeat motif located in exon 10 of the gene. In the first approach, a CRISPR-Cas9 system was developed to disrupt the ATXN3 gene. Upon CRISPR-Cas9 delivery, the reduction in the protein levels was observed in in vitro and in vivo models of MJD/SCA3. Importantly, and contrarily to the results obtained using TALENs, a marked amelioration of the neuropathological signs in the lentiviral-based mouse model of MJD/SCA3 was observed upon ATXN3 inactivation. In the second approach, CRISPR-Cas9 components were designed to excise the CAG tract. When simultaneously targeting upstream and downstream regions of the CAG tract in a human cell line, the elimination of the CAG motif was achieved, leading to the formation of ATXN3 protein versions with decreased molecular weight. Lastly, in chapter 5 final conclusions and future directions are presented. In summary, the present thesis provides i) a simple and cost-effective methodology for the simultaneous characterization of the CAG tract and flanking polymorphisms in MJD/SCA3, allowing the selection of cells (in vitro studies) and patients (future clinical trials) for either allele-specific or non-allele specific therapeutic approaches and ii) evidence of the effectiveness of gene editing approaches for MJD/SCA3, either by the permanent inactivation of ATXN3 gene or by the elimination of the disease-causing mutation in the human gene. Importantly, this thesis provides the first in vivo evidence of the efficacy of a CRISPR-Cas9-based approach to permanently inactivate the ATXN3 gene, supporting its potential as a putative therapeutic avenue in the context of MJD/SCA3.

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), é a ataxia hereditária autossómica dominante mais comum no mundo. Esta doença neurodegenerativa é uma das nove doenças conhecidas como doenças de poliglutaminas (poliQ), sendo causada por uma expansão do número de repetições do trinucleótido CAG localizado no exão 10 do gene humano da ataxina-3 (ATXN3). Uma expansão deste tripleto acima de 61 repetições, leva à formação da proteína ATXN3, que possui uma sequência de poliQ expandida. A proteína mutada adquire propriedades toxicas, desencadeando múltiplas vias patogénicas que culminam em disfunção neuronal e neurodegenerescência em regiões específicas do cérebro, como sejam o cerebelo, tronco cerebral e estriado. Até ao momento a DMJ/SCA3 continua a ser uma doença incurável, e uma vez que não existe nenhuma terapia disponível capaz de parar ou atrasar a sua progressão, o tratamento destes doentes baseia-se maioritariamente no alívio de alguns sintomas específicos e em tratamentos de reabilitação. No entanto, um progresso surpreendente no desenvolvimento de abordagens terapêuticas promissoras para esta doença tem vindo a verificar-se. Tendo em conta o ganho de função tóxico adquirido pelas formas expandidas da proteína ATXN3, estratégias que visam o bloqueio da produção destas formas mutantes em regiões cerebrais afetadas na doença, como é o caso da via de interferência de ARN ou dos oligonucleótidos antisense, têm mostrado resultados encorajadores. No entanto, embora limitem a progressão da doença, estas estratégias que visam o ARN mensageiro, poderão apenas produzir um efeito terapêutico incompleto ou transitório nas células ou tecidos alvo, não permitindo desta forma a cura da doença. Por atuarem ao nível do ADN, as tecnologias de edição de genoma têm sido usadas para inativar ou corrigir de forma permanente genes relacionados com doenças, constituindo por isso a promessa para o desenvolvimento de uma cura definitiva para várias doenças hereditárias, como sejam a DMJ/SCA3. Assim sendo, o objetivo deste projeto consistiu na caracterização do número de repetições do tripleto CAG e dos polimorfismos flanqueadores em doentes com DMJ/SCA3, bem como no desenvolvimento de potenciais estratégias terapêuticas baseadas nas tecnologias de edição de genoma, colmatando a patogenicidade da DMJ/SCA3 através de duas possíveis abordagens: i) a inativação permanente do gene ATXN3 humano ou ii) a excisão da região do gene que contém os CAGs. Na primeira parte deste projeto, descrita no capítulo 2, foi desenvolvido um protocolo para superar as dificuldades técnicas relacionadas com a caracterização molecular do trato de CAGs e polimorfismos intragénicos na DMJ/SCA3. Um único par de primers foi desenhado e validado, e dois métodos complementares baseados em PCR foram estabelecidos. No método I, os produtos de PCR foram clonados e sequenciados, permitindo a avaliação de três polimorfismos localizados na vizinhança da repetição dos CAGs (C987GG/G987GG, TAA1118/TAC1118 e C1178/A1178), os quais poderão constituir potenciais alvos para terapias personalizadas. O Método II combina a técnica de PCR, eletroforese capilar e uma fórmula de correção de tamanho, permitindo a determinação do número de CAGs de forma rápida e com baixo custo. No capítulo 3, nucleases baseadas em efetores do tipo ativador de transcrição (TALENs) foram usadas para inativar permanentemente o gene implicado na DMJ/SCA3. A capacidade das TALENs em promover a edição do gene da ATXN3 foi demonstrada em modelos in vitro e in vivo da doença. Uma diminuição eficiente dos níveis da proteína ATXN3 foi também demonstrada num modelo de murganho da DMJ/SCA3, após injeção estereotáxica de vetores virais que codificam para sequências de TALEN. No entanto, apesar da eficácia demonstrada no silenciamento do gene da ATXN3, o aumento da disfunção neuronal e da neuroinflamação foram observados nos hemisférios cerebrais tratados, indicando a falta de tolerabilidade da estratégia desenvolvida. No capítulo 4, o potencial terapêutico do sistema de repetições palindrómicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas (CRISPR)-Cas9 foi avaliado no contexto da DMJ/SCA3. Dois mecanismos de ação foram explorados em paralelo: i) a inativação permanente do gene da ATXN3 e ii) a excisão do motivo de repetições de CAGs localizado no exão 10 do referido gene. Na primeira abordagem, o sistema CRISPR-Cas9 foi adaptado para promover a disrupção do gene da ATXN3. Após a entrega do sistema de CRISPR-Cas9, observou-se uma redução nos níveis da proteína em modelos in vitro e in vivo da DMJ/SCA3. Notavelmente, e contrariamente aos resultados obtidos com o uso das TALEN, observou-se neste caso uma assinalável melhoria dos sinais neuropatológicos no modelo de murganho da DMJ/SCA3 após a inativação do gene da ATXN3. Na segunda abordagem, os componentes do sistema de CRISPR-Cas9 foram desenhados para excisar o trato de CAGs. Ao direcionar este sistema simultaneamente para as regiões a montante e a jusante do trato de CAGs numa linha celular humana, foi possível promover a eliminação da região do gene que inclui o motivo de CAGs, levando à formação de versões da proteína ATXN3 com um menor peso molecular. Por fim, no capítulo 5 são apresentadas as conclusões finais e as perspetivas futuras. Em resumo, esta dissertação apresenta i) uma metodologia simples e económica para a caracterização simultânea do trato de CAGs e polimorfismos flanqueadores na DMJ/SCA3, permitindo a seleção de células (estudos in vitro) e pacientes (futuros ensaios clínicos) elegíveis para abordagens terapêuticas alelo-específicas ou não alelo-específicas e ii) evidência da eficácia das abordagens de edição de genes para a DMJ/SCA3, seja pela inativação permanente do gene da ATXN3 ou pela eliminação da mutação causadora da doença. É importante realçar que esta tese constitui a primeira evidência in vivo da eficácia do sistema de CRISPR-Cas9 para inativar permanentemente o gene da ATXN3, demonstrando o seu potencial como uma possível estratégia terapêutica para a DMJ/SCA3.