Dynamic changes of aerobic brain oxidative metabolism revealed by lactate and the redox modulation by nitrite

Abstract

The brain is a highly active organ with high and constant energetic needs. The main energy substrate in the brain is glucose, but lactate has also been suggested to play an important role involving a rather complex mechanism that allows for a rapid supply of energy substrates to respond to the increased energy needs during activity. Mounting evidence supports a role for lactate in such neurometabolic coupling, but the underlying mechanisms are still under debate and need further clarification. Disruption in substrate supply to the brain has profound metabolic physiological consequences. For instance, a decrease in glucose and oxygen supply due to a compromised cerebral blood flow results in stroke. Improving the outcome of this deadly disease can increase survivability and quality of life for patients. One possible strategy for this involves the modulation of mitochondrial oxidative metabolism by nitrite, a substance that may act a metabolic precursor of nitric oxide, in particular at low pH and in the presence of reductants such as ascorbic acid. The main purpose of this work was to study the role of lactate and nitrite in brain energy metabolism under a physiological and pathophysiology viewpoint in the hippocampus. This work involves both scientific and technological components. In order to address the modulation of neurometabolism by lactate and nitrite there was the need to design and develop two new tools, namely (a) a sample holder designed to fit a respirometry system, allowing for the monitoring of whole hippocampal tissue oxidative metabolism through measurements of oxygen consumption rates while maintaining the tissue integrity throughout the experiment duration and (b) a lactate microbiosensor with the purpose of monitoring lactate dynamics in brain tissue slices. The lactate microbiosensors consisted of platinized carbon fiber microelectrodes with lactate oxidase immobilized and a permeable membrane to increase selectivity. They were proven to produce reliable lactate measurements, with high sensitivity and selectivity, low limit of detection, and extended operational stability, representing a good resource for studies on the role of lactate in neurometabolic coupling. Regarding the role of lactate in neurometabolic coupling, this work supports that glucose concentration modulates both the rate of tissue oxygen consumption and the extracellular lactate concentration, which is maintained within a limited and physiological range. The increase of lactate in response to glucose supports the notion that lactate is produced during aerobic glycolysis and released into the extracellular space. Interestingly, exogenously added lactate can also increase the rate of tissue respiration at rest independently of glucose concentration. It was also demonstrated that neurons uptake lactate from the extracellular space to fuel oxidative metabolism both under resting and neural activation conditions, providing a mean to better respond to the metabolic demands imposed by stimulation. Finally, this work supports nitrite as a modulator of hippocampal slice oxidative metabolism in an in vitro model of ischemia/reperfusion (I/R). An oxidative burst was observed immediately after I/R, presumably associated with increased reactive oxygen species production that mediate a part of the damage from I/R. Nitrite, in a concentration attainable in vivo, decreased this oxidative burst, and the underlying mechanism, although not clearly discerned, might be related with the modulation of mitochondrial respiration, in particular via inhibition of complex I linked respiration. In conclusion, the work developed in this thesis presented new tools that can be used to study neurometabolism in brain tissue and allowed to probe into the mechanistic of the role of lactate as a substrate and nitrite as a modulator in brain oxidative metabolism, under both physiological and pathophysiological conditions, suggesting new strategies to modulate disease-related neural energetic metabolism.

No organismo humano, o cérebro requer um suprimento mais elevado de glicose e oxigénio relativamente a outros órgãos e dispõe de reservas de glicogénio limitadas. Embora a glucose seja considerada o substrato energético principal do cérebro, estudos diversos sugerem que o lactato desempenha uma função importante no metabolismo cerebral. O lactato aparenta estar envolvido num complexo mecanismo que envolve a interação entre astrócitos e neurónios e que permite uma resposta mais eficaz ao aumento da necessidade energética imposta pela atividade sináptica. No entanto, a função do lactato neste processo, o acoplamento neurometabólico, tem sido suportado por vários estudos que, por regra, são não só inconclusivos como controversos. A alta necessidade energética do cérebro sugere que alterações no suprimento de substratos ao tecido cerebral tem consequências disfuncionais severas. Um exemplo notório é o deficiente suprimento de oxigénio e glucose a uma região cerebral durante o acidente vascular cerebral (AVC). Paradoxalmente, a reoxigenação origina uma cascata tóxica em que intervêm como componentes críticos radicais e oxidantes (espécies reativas de oxigénio, ROS) com origem predominantemente na mitocôndria. Neste contexto, o nitrito tem sido apontado como uma substância moduladora do metabolismo oxidativo, com efeitos positivos em modelos de AVC. Assim, o objetivo principal deste trabalho é estudar a modulação do metabolismo energético cerebral pelo lactato num contexto fisiológico e pelo nitrito num contexto patológico, nomeadamente num modelo de AVC, numa estrutura cerebral específica, o hipocampo. Para este fim, para além da componente científica este trabalho incorpora também uma componente tecnológica, dada a necessidade do desenvolvimento de ferramentas novas para o estudo da ação moduladora de lactato e de nitrito no metabolismo cerebral, nomeadamente (a) um suporte adaptável ao equipamento de alta resolução para medições de taxas de consumo de oxigénio em tecido cerebral como meio de avaliação do metabolismo oxidativo, mantendo o tecido íntegro ao longo do período experimental e (b) um microbiossensor de lactato para monitorizar dinâmicas de lactato em fatias de tecido cerebral. Os microbiosensores consistem em microelétrodos de fibra de carbono platinizados com a enzima lactato oxidase imobilizada e uma membrana permeável para aumentar a seletividade. Com estes sensores foram obtidas medições dinâmicas de lactato em fatias de hipocampo, demonstrando alta sensibilidade e seletividade, baixo limite de deteção e estabilidade operacional, representando assim uma boa opção para medições dinâmicas de lactato extracelular em tecido cerebral. Relativamente à ação do lactato no acoplamento neurometabólico, os resultados mostraram que a concentração de glucose no meio, além de influenciar o consumo de oxigénio pelo tecido, determina a concentração extracelular de lactato, que se manteve dentro de um intervalo limitado e fisiológico. Este aumento da concentração de lactato em resposta a um aumento da concentração de glucose suporta a noção de que o lactato é produto da glicólise aeróbica e é libertado no espaço extracelular. Além disso, o lactato adicionado exogenamente aumenta a taxa de respiração do tecido de uma forma independente da concentração de glucose. Também foi demonstrado que os neurónios captam lactato do espaço extracelular para aumentar o metabolismo oxidativo tanto em condições basais como em atividade, podendo assim permitir uma melhor resposta às necessidades energéticas impostas pela estimulação. Por último, foi demonstrado que o nitrito modula o metabolismo oxidativo em fatias de hipocampo num modelo in vitro de isquemia/reperfusão (I/R), utilizado para mimetizar as condições observadas num AVC. Foi observado um aumento significativo do metabolismo oxidativo imediatamente após a I/R, que poderá estar associado a um aumento de espécies reativas de oxigénio envolvidas nos danos provocados por I/R. O nitrito, numa concentração que pode ser obtida in vivo, diminui este aumento oxidativo, provavelmente por alteração da atividade de complexos respiratórios, nomeadamente a inibição da respiração ligada ao complexo I. Concluindo, o trabalho desenvolvido nesta tese, para além do desenvolvimento de novas ferramentas para estudar metabolismo oxidativo em tecido cerebral, revelou aspetos mecanísticos relacionados com a ação de lactato e nitrito no metabolismo cerebral, quer do ponto de vista fisiológico quer fisiopatológico, abrindo caminho para a sua potencial utilização na modulação de disfunções metabólicas relacionadas com doença do cérebro.