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Title: Insights into the mechanisms of intracellular delivery of targeted liposomal doxorubicin/ceramides combinations and the importance to assess the nature of drug interaction beyond bulk tumor cells
Authors: Cruz, Ana Filipa Fernandes da 
Orientador: Moreira, João Nuno Sereno Almeida
Simões, Sérgio Paulo Magalhães
Keywords: Triple-negative breast cancer; doxorubicin; C6-ceramide; C18-ceramide; nature of drug interaction; synergistic combinations; cancer stem cells; nucleolin; ovarian cancer; phospho-Akt downregulation; Cancro da mama triplo-negativo; doxorrubicina; ceramida- C6; ceramida-C18; natureza da interação entre fármacos; combinações sinergísticas; células estaminais cancerígenas; nucleolina; cancro do ovário; diminuição da phospho- Akt.
Issue Date: 28-Jul-2022
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH%2FBD%2F85554%2F2012/PT 
CENTRO-01-0145-FEDER-000012 (HealthyAging2020)
POCI-01-0145-FEDER-016390 (CancelStem)
ENMed/0005/2015 (Euronanomed) 
UIDB/04539/2020 (CIBB) 
UIDP/04539/2020 (CIBB)
LA/P/0058/2020 (CIBB) 
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Cancer is one of the leading causes of death worldwide and responsible for an estimated 10 million deaths in 2020. Among them, female breast and ovary represented 6.9% and 2.1%, respectively, of the total of cancer deaths in 2020. Tumor development and progression relies on a complex signaling network of deregulated pathways, as the PI3K/Akt pathway, sustaining cell proliferation, growth and survival. Additionally, tumor microenvironment is constituted by different cellular populations, including cancer cells, cancer stem cells (CSCs), endothelial cells, immune inflammatory cells and cancer-associated fibroblasts, that contribute to the tumor pathogenesis. In fact, CSCs have been described as tumorigenic and involved in drug resistance, tumor recurrence and metastasization. Moreover, the plasticity associated with CSCs and non-stem cancer cells, which interconvert according to environmental stimuli, illustrates the cellular dynamics within the tumor microenvironment and contributes to drug resistance and tumor progression. It is thus recognized that drug combinations targeting different cellular populations and/or signaling pathways are paramount to successful tackle cancer heterogeneity. In this respect, synergistic interaction of anticancer drugs can provide significant improvements in efficacy and/or dose reduction, while maintaining therapeutic efficacy and avoiding toxicity. Furthermore, the identification of common markers among different tumor cell populations could increase efficacy of new anticancer therapeutic strategies. Therefore, nucleolin emerged as a potential common marker for different breast tumor cell populations due to the demonstration of its overexpression on the cell surface of breast CSCs, non-stem breast cancer cells and endothelial cells from the tumor blood vessels. Moreover, co-encapsulation and delivery of doxorubicin (DXR) and ceramides have the potential to circumvent one of the resistance mechanisms to DXR - the overexpression of glucosylceramide synthase, an enzyme described to metabolize ceramides. In fact, the overexpression of glucosylceramide synthase could reduce the accumulation of endogenous pro-apoptotic ceramides induced by DXR, further decreasing the cytotoxic effects. Thus, the co-administration of exogenous ceramides and DXR could enhance antitumor effects. Herein, in chapter 2, the impact of short (C6) and long (C18) alkyl chain length ceramides on cell viability and on the nature of drug interaction, within the scope of co-encapsulation with DXR in pegylated and pH-sensitive liposomes functionalized with the nucleolin-binding F3 peptide, was assessed in bulk triple-negative breast cancer (TNBC) cells. Additionally, the effect of the targeted liposomal combinations was evaluated on the percentage of ALDH+/high putative triple-negative breast CSC population and phenotype, including mammosphere-forming capacity and live single-cell tracking. In chapter 3, the ability of the developed pegylated and pH-sensitive liposomes containing DXR/C6-ceramide combination, to target, in vitro, cells of histological origin other than breast cancer (namely, ovarian cancer cells, including ovarian CSCs) was assessed. Lastly, the underlying molecular mechanism of action of the nucleolin-mediated intracellular delivery of C6-ceramide to cancer cells of different histological origin was explored. The targeted liposomal combinations of DXR/C6- or C18-ceramide, at a 1:1 molar ratio, at death fractions of either 0.5 (IC50) or 0.9 (IC90), at 4 or 24 h incubation, enabled a synergistic drug interaction in all (bulk) TNBC cell lines tested (MDA-MB-231, MDA-MB-468 and Hs578T). However, the assessment at the level of corresponding putative CSC population (defined as ALDH+/high) revealed a cell-dependent effect. MDA-MB-468 cells provided the most striking result among all the cell lines tested. Increasing concentrations of DXR/C18- or C6-ceramide targeted liposomal combinations enabled a maximum of bulk cell death up to 89.1 and 98.8%, along with a 2.9- and 6.2-fold decrease of the percentage of viable ALDH+/high putative CSCs, respectively. The opposite effect was observed in MDA-MB-231 cells. In these cells, the fold change relative to untreated percentage of viable ALDH+/high cells remained unchanged for both targeted combinations, although in the one with C6-ceramide, was higher than untreated cells and in contrast with the result provided by the combination with C18-ceramide. Considering the divergent impact of liposomal combinations comprising DXR and C6- or C18-ceramide on ALDH+/high putative CSCs, depending on the cell line tested, their effect on the phenotype of triple-negative breast CSCs as, for example, on the mammosphere forming efficiency (MFE) and cellular migration, became of high relevance. F3 peptide-targeted liposomal combinations of DXR and C6- or C18-ceramide resulted in a decrease of primary MFE of MDA-MB-468 cells (MFE of 6.1 and 5.1%, respectively) relative to the untreated control (MFE of 15.7%, p<0.01 or 0.05, respectively). A similar pattern of significant MFE impairment enabled by the targeted liposomal formulations, relative to untreated cells, was observed with the MDA-MB-231 and Hs578T cells, without major differences in the relative extent among C6- and C18-ceramide formulations, except for Hs578T cells. In these cells, an increase of MFE was observed, upon incubation with the liposomal combination of DXR and C18-ceramide (MFE of 4.0%) relative to the incubation with the liposomal combination of DXR and C6-ceramide (MFE of 1.1%, p<0.05). Additionally, the impact on the migratory potential of TNBC cells, as an indicator of the invasion and metastatic potential, was further assessed for both targeted formulations by live single-cell tracking. While they have both enabled a significant decrease in migration velocity and accumulated distance parameters, relative to untreated control, among all the cell lines tested, the impact of the C6- or C18-ceramide combinations depended on the intrinsic phenotype of each cell line. On MDA-MB-468 cells, characterized by an epithelial phenotype, both C6- and C18-ceramide liposomal combinations enabled a significant decrease in velocity and accumulated distance, relative to untreated control, and at a similar extent among them. A similar pattern was observed with the Hs578T cells, characterized by a mesenchymal-like phenotype. The only difference relied at the level of the Euclidean distance (length of the straight-line distance connecting the starting and ending points of cell migration), where the formulation incorporating C6-ceramide induced higher reduction of the straight segment of migration than the C18 counterpart. In the case of highly motile MDA-MB-231 cells, different results were observed. Not only significant differences relative to untreated cells were identified for all the three migration parameters assessed, but also the F3 peptide-targeted combination of DXR and C6-ceramide induced a statistically significant decrease on each of those parameters, relative to the C18-ceramide counterpart. The decrease of the migratory potential enabled by the targeted liposomal combinations is of high relevance in the context of TNBC, due to the underlying metastatic potential. Hereafter, a potential application of the F3 peptide-targeted liposomal DXR and C6-ceramide combination on cancer cells of histological origin other than breast cancer was evaluated. Therefore, the ability of the F3 peptide-targeted liposomal combination to target ovarian cancer cells, including ovarian CSCs, was assessed. The assessment of overexpression of surface nucleolin by flow cytometry was in line with the significant extent of uptake into (bulk) ovarian SKOV-3, OVCAR-3 and TOV-112D cancer cells, relative to non-targeted and non-specific counterparts. This pattern of uptake was recapitulated with putative CSC-enriched ovarian SKOV-3 and OVCAR-3 sub-population (EpCAMhigh/CD44high). Nevertheless, co-encapsulation of DXR/C6-ceramide into F3 peptide-targeted liposomes improved cytotoxic activity relative to liposomes containing DXR alone, in an extent that depended on the intrinsic resistance to DXR and on the incubation time. The analysis of the IC90 values clearly evidenced that the SKOV-3 cell line is the most resistant one to the majority of the tested liposomal samples (IC90 higher than 50 µM), encapsulating either single (DXR) or drug combinations, targeted or non-targeted, for both 4 or 8 h incubation time. In fact, only the targeted drug combinations, either at a 1:1 ([F3]L-DC611) or 1:2 molar ratio ([F3]L-DC612) enabled a measurable 90% of SKOV-3 cancer cells cytotoxicity (22.61 and 16.69 µM, respectively), following an 8 h incubation. On the other hand, the more sensitive the cell line, the smaller the differences among the IC90 values. To unravel some of the mechanisms supporting the enhanced efficacy of the targeted drug combination, the capability of the developed F3 peptide-targeted lipid-based nanoparticle to enable intracellular drug delivery was assessed upon quantifying intracellular DXR and C6-ceramide by mass spectrometry. Interestingly, similar intracellular levels of C6-ceramide in ovarian cancer SKOV-3 and triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell lines, upon delivery by non-targeted (L-DC611) and targeted ([F3]L-DC611) liposomes, suggested a passive delivery process. In contrast, intracellular accumulation of DXR enabled by the targeted formulations ([F3]L-DC611 and [F3]L-D) was always significantly higher than the one from the non-targeted counterpart (L-DC611), suggesting that F3-peptide mediated an active intracellular delivery of DXR. Additionally, the mechanistic contribution of C6-ceramide to the improved cytotoxicity of F3 peptide-targeted liposomal combination was explored. Thus, as ceramides have been reported to inhibit the PI3k/Akt pathway, it was then questioned whether the mechanism remains the same upon intracellular delivery mediated by the F3 peptide/nucleolin system into cancer cells of different histological origin and with different basal levels of phosphorylated/active Akt. On MDA-MB-231 cells, characterized by the lowest levels of phospho-Akt, a clear dose- and time-dependent decrease of the phosphorylated protein was observed. The effect became significant at 4 µM F3 peptide-targeted liposomal C6-ceramide onward, following 4 or 24 h of incubation, relative to untreated cells. At 64 µM, a 5.4- or 25.8-fold decrease on p-Akt levels were observed following 4 or 24 h, respectively, relative to untreated control. A similar dose- and time-dependent trend was observed with MDA-MB-435S, characterized by similar levels of phospho-Akt. As the levels of p-Akt doubled, as in the case of SKOV-3 cells, a significant decrease of the phosphorylated protein became significant only at 32 or 64 µM of F3 peptide-targeted liposomal C6-ceramide. In this case, the previously referred time-dependent effect was not evident. Altogether, the results presented in chapters 2 and 3 of this thesis demonstrated that the nature of the drug interaction assessed at the level of bulk cancer cells revealed to be insufficient to predict whether a drug combination enables a decrease in the percentage of the master regulators of tumor relapse as ALDH+/high putative triple-negative breast CSCs, suggesting, for the first time, that the assessment of the nature of drug interaction should be extended further down to this level. Moreover, the enhanced efficacy of the targeted combination DXR/C6-ceramide was mechanistically supported by the downregulation of PI3K/Akt pathway by C6-ceramide, only among the nucleolin-overexpressing cancer cells presenting a basal p-Akt/total Akt ratio lower than 1.
O cancro é uma das principais causas de morte no mundo e foi responsável por cerca de 10 milhões de mortes em 2020. Entre as quais, 6.9 e 2.1% do total de mortes de mulheres foram atribuídas ao cancro da mama e do ovário, respetivamente. O desenvolvimento e progressão tumoral depende de uma complexa rede de vias de sinalização, tal como a via da PI3K/Akt, que suporta a proliferação, o crescimento e a sobrevivência celular. Além disso, o microambiente tumoral é constituído por diferentes populações celulares, incluindo células cancerígenas, células estaminais cancerígenas (CSCs), células endoteliais, células inflamatórias do sistema imunitário e fibroblastos associados ao cancro, que contribuem para a patogénese do tumor. As CSCs têm sido descritas como tumorigénicas e como estando envolvidas no desenvolvimento de resistência aos fármacos, recidivas tumorais e formação de metástases. Além disso, a plasticidade associada às células estaminais e não estaminais cancerígenas, que têm a capacidade de se interconverter de acordo com estímulos ambientais, ilustra a dinâmica celular dentro do microambiente tumoral e contribui para o desenvolvimento de resistência à terapêutica e progressão tumoral. Assim, é reconhecido que as combinações de fármacos direcionadas para diferentes populações celulares e/ou vias de sinalização são fundamentais para combater com sucesso a heterogeneidade tumoral. A este respeito, uma interação sinergística entre fármacos anticancerígenos pode proporcionar melhorias significativas na eficácia e/ou redução da dose, mantendo a eficácia terapêutica e evitando a toxicidade. Além disso, a identificação de marcadores comuns a diferentes populações de células tumorais pode aumentar a eficácia de novas estratégias terapêuticas anticancerígenas. Assim, a nucleolina surgiu como um potencial marcador comum a diferentes populações de células de cancro da mama porque a sua sobre-expressão foi demonstrada à superfície de células estaminais e não estaminais de cancro da mama e de células endoteliais dos vasos sanguíneos tumorais. Adicionalmente, a co-encapsulação e a entrega de doxorrubicina (DXR) e ceramidas tem o potencial de contornar um dos mecanismos de resistência à doxorrubicina - a sobre-expressão da glucosilceramida sintase, uma enzima capaz de metabolizar ceramidas. Na verdade, a sobre-expressão da glucosilceramida sintase pode reduzir a acumulação de ceramidas pró-apoptóticas endógenas induzidas pela DXR, diminuindo assim os efeitos citotóxicos. Por isso, a coadministração de ceramidas exógenas e DXR pode potenciar os efeitos antitumorais. Por conseguinte, no capítulo 2, foi estudado o impacto de ceramidas de cadeia alquilo curta (C6) e longa (C18) na natureza da interação entre fármacos, no âmbito da co-encapsulação com a DXR em lipossomas direcionados pelo peptídeo F3, em células de cancro da mama triplo-negativo (TNBC). Foi também avaliado o efeito das combinações lipossómicas direcionadas na percentagem de células que expressam elevados níveis da enzima aldeído desidrogenase (ALDH+/high) e no fenótipo das CSCs de cancro da mama triplo-negativo, incluindo a capacidade de formação de esferas e a migração celular. No capítulo 3, foi avaliada a capacidade dos lipossomas desenvolvidos, PEGuilados, sensíveis ao pH e contendo a combinação DXR/ceramida-C6, para se associarem, in vitro, a células de origem histológica diferente das do cancro da mama (nomeadamente, células de cancro do ovário, incluindo CSCs de ovário). Por último, foi explorado o mecanismo de ação a nível molecular subjacente à entrega intracelular mediada pela nucleolina da ceramida-C6 a células cancerígenas de diferentes origens histológicas. Os lipossomas direcionados que contêm a combinação DXR/ceramida-C6 ou -C18, numa proporção molar de 1:1, nas frações que provocaram 50% (fa_0.5) ou 90% (fa_0.9) de citotoxicidade, em 4 ou 24 h de incubação, permitiram uma interação sinergística em todas as linhas celulares de TNBC testadas (MDA-MB-231, MDA-MB-468 e Hs578T). No entanto, a avaliação ao nível da população de CSCs correspondente (definida como ALDH+/high) revelou um efeito dependente da linha celular. As células MDA-MB-468 proporcionaram o resultado mais marcante entre todas as linhas celulares testadas. Concentrações crescentes das combinações lipossómicas DXR/ceramida-C18 ou -C6 permitiram um máximo de morte celular total de 89,1 e 98,8%, juntamente com uma diminuição de 2,9 e 6,2 vezes da percentagem de células ALDH+/high viáveis, respetivamente. O efeito oposto foi observado nas células MDA-MB-231. Nestas, a percentagem de células viáveis ALDH+/high permaneceu inalterada mediante incubação com as combinações lipossómicas direcionadas. No entanto, no caso das células incubadas com a combinação DXR/ceramida-C6 essa percentagem foi maior do que a percentagem de células viáveis ALDH+/high no controlo não tratado. Assim, tendo em consideração o impacto divergente das combinações lipossómicas contendo a combinação DXR/ceramida-C6 ou -C18 em células ALDH+/high, dependendo da linha celular testada, tornou-se bastante relevante estudar o seu efeito no fenótipo de CSCs de cancro da mama triplo-negativo como, por exemplo, na eficiência de formação de mamosferas (MFE) e migração celular. As combinações lipossómicas contendo DXR e ceramida-C6 ou -C18 direcionadas pelo peptídeo F3 resultaram numa diminuição da MFE de células MDA-MB-468 (MFE de 6,1 e 5,1%, respetivamente) em relação ao controlo não tratado (MFE de 15,7%, p<0,01 ou 0,05, respetivamente). Foi observado um padrão semelhante de comprometimento significativo da MFE proporcionado pelas formulações lipossómicas direcionadas, em relação às células não tratadas, nas células MDA-MB-231 e Hs578T, sem grandes diferenças na extensão relativa entre as formulações contendo a ceramida-C6 ou -C18, exceto para as células Hs578T. Nestas células, foi observado um aumento da MFE, após a incubação com a combinação lipossómica DXR/ceramida-C18 (MFE de 4,0%) em relação à combinação homóloga contendo ceramida-C6 (MFE de 1,1%, p <0,05). Adicionalmente, o impacto das combinações lipossómicas direcionadas no potencial migratório das células de TNBC foi avaliado através da monitorização do movimento de migração celular, que pode funcionar como um indicador do potencial de invasão e metastático. Embora ambas as combinações tenham permitido uma diminuição significativa nos parâmetros velocidade e distância acumulada de migração, em relação ao controlo não tratado, em todas as linhas celulares testadas, o impacto das combinações contendo a ceramida-C6 ou -C18 dependeu do fenótipo intrínseco de cada linha celular. Nas células MDA-MB-468, caracterizadas por um fenótipo epitelial, as combinações lipossómicas contendo ceramida-C6 ou -C18 permitiram uma diminuição significativa na velocidade e na distância acumulada, em relação ao controlo não tratado, e numa extensão semelhante entre elas. Um padrão semelhante foi observado nas células Hs578T, caracterizadas por um fenótipo mesenquimal. A única diferença verificou-se ao nível da distância euclidiana (comprimento da distância em linha reta que une os pontos inicial e final da migração celular), em que a formulação contendo ceramida-C6 induziu uma maior redução desta distância de migração comparativamente à formulação contendo a ceramida-C18. No caso das células MDA-MB-231, que têm uma elevada motilidade, foram observados resultados diferentes. Além das diferenças significativas identificadas em todos os três parâmetros de migração avaliados em relação às células não tratadas, os lipossomas contendo a combinação DXR/ceramida-C6 direcionados pelo peptídeo F3 induziram uma diminuição estatisticamente significativa em cada um desses parâmetros, em relação à formulação homóloga contendo a ceramida-C18. A diminuição do potencial migratório proporcionado pelas combinações lipossómicas direcionadas é extremamente relevante no contexto do TNBC, devido ao potencial metastático subjacente. De seguida, foi avaliada uma potencial aplicação da combinação lipossómica, contendo DXR/ceramida-C6, direcionada pelo peptídeo F3 em células cancerígenas de origem histológica diferente do cancro da mama. Assim, a capacidade desta combinação lipossómica para atingir células de cancro de ovário, incluindo CSCs de ovário, foi investigada. A avaliação da sobre-expressão de nucleolina à superfície das células por citometria de fluxo revelou estar em concordância com a maior extensão de associação celular dos lipossomas direcionados em células de cancro de ovário (SKOV-3, OVCAR-3 e TOV-112D) em relação aos homólogos não direcionadas e não específicos. Este padrão de associação celular foi recapitulado na subpopulação de células de cancro do ovário (SKOV-3 e OVCAR-3) enriquecida em CSCs (EpCAMhigh/CD44high). No entanto, a co-encapsulação de DXR e ceramida-C6 em lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 melhorou a atividade citotóxica em relação aos lipossomas contendo apenas DXR, numa extensão que dependeu da resistência intrínseca à DXR e do tempo de incubação. A análise dos valores de IC90 evidenciou claramente que a linha celular SKOV-3 é a mais resistente à maioria das amostras lipossómicas testadas (IC90 superior a 50 µM), tanto encapsulando apenas DXR ou as combinações de fármacos, direcionadas ou não, tanto para 4 como para 8 h de incubação. Na verdade, apenas as combinações de fármacos direcionadas, DXR:ceramida-C6 numa proporção molar de 1:1 ([F3]L-DC611) ou 1:2 ([F3]L-DC612) proporcionaram uma citotoxicidade mensurável de 90% das células cancerígenas SKOV-3 (22,61 e 16,69 µM, respetivamente), após 8 h de incubação. Por outro lado, quanto mais sensível a linha celular, menores as diferenças entre os valores de IC90. Para esclarecer alguns dos mecanismos que suportam a maior eficácia dos lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 contendo a combinação DXR/ceramida-C6, a capacidade destes lipossomas para permitir a entrega intracelular de fármacos foi avaliada através da quantificação intracelular de DXR e ceramida-C6 por espectrometria de massa. Curiosamente, os níveis intracelulares de ceramida-C6 em linhas celulares de cancro do ovário, SKOV-3, e TNBC, MDA-MB-231, foram semelhantes mediante a entrega pelos lipossomas não direcionados (L-DC611) e direcionados ([F3]L-DC611), o que sugere um processo de entrega passiva da ceramida-C6. Pelo contrário, a acumulação intracelular de DXR proporcionada pelas formulações direcionadas ([F3]L-DC611 e [F3]LD) foi sempre significativamente maior que a da formulação não direcionada (L-DC611), sugerindo que o peptídeo F3 tem a capacidade de mediar uma entrega intracelular ativa de DXR. Adicionalmente, a contribuição mecanística da ceramida-C6 para o aumento de citotoxicidade da combinação lipossómica direcionada pelo peptídeo F3 foi explorada. Assim, como as ceramidas têm sido descritas como sendo capazes de inibir a via PI3K/Akt, questionou-se então se o mecanismo permanece o mesmo após a entrega intracelular mediada pelo sistema peptídeo F3/nucleolina em células cancerígenas de origem histológica diferente e com diferentes níveis basais de fosforilação/ativação da Akt (p-Akt). Nas células MDA-MB-231, caracterizadas pelos níveis basais mais baixos de p-Akt, foi observada uma clara diminuição da proteína fosforilada dependente da dose e do tempo. O efeito tornou-se significativo a partir de 4 µM de ceramida-C6 lipossómica direcionada pelo peptídeo F3, após 4 ou 24 h de incubação, em relação às células não tratadas. A 64 µM, foi observada uma diminuição de 5,4 ou 25,8 vezes nos níveis de p-Akt após 4 ou 24 h, respetivamente, em relação ao controlo não tratado. Uma tendência semelhante, dependente da dose e do tempo, foi observada nas células MDA-MB-435S, caracterizadas por níveis semelhantes de p-Akt. À medida que os níveis basais de p-Akt duplicaram, como no caso das células SKOV-3, a diminuição da proteína fosforilada tornou-se significativa apenas a 32 ou 64 µM de ceramida-C6 lipossómica direcionada pelo peptídeo F3. Neste caso, o efeito dependente do tempo referido anteriormente não foi evidente. No seu conjunto, os resultados apresentados nos capítulos 2 e 3 desta tese demonstraram que a natureza da interação entre fármacos avaliada no total de células cancerígenas revelou ser insuficiente para prever se uma combinação de fármacos permite a diminuição da percentagem de células apontadas como as principais responsáveis por recidivas tumorais, como as CSCs de cancro da mama triplo-negativo, ALDH+/high, sugerindo, pela primeira vez, que a avaliação da natureza da interação entre fármacos deve ser estendida a este nível. Além disso, o aumento da eficácia da combinação direcionada DXR/ceramida-C6 foi suportada mecanisticamente pela diminuição da ativação da via PI3K/Akt pela ceramida-C6, apenas entre as células cancerígenas que sobre-expressam nucleolina e que apresentam uma razão p-Akt/Akt basal total inferior a 1.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, ramo de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.
Rights: embargoedAccess
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