Mecanismos moleculares associados à resistência adquirida a inibidores do proteasoma em mieloma múltiplo

Abstract

O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação de plasmócitos malignos, produtores de imunoglobulinas monoclonais, e pela presença de eventos definidores de mieloma. O conhecimento das vias moleculares envolvidas no MM permitiu o desenvolvimento dos inibidores de proteasomas (PIs) – bortezomib (BTZ), carfilzomib (CFZ) e ixazomib (IXZ), entre outros fármacos dirigidos a alvos moleculares. Contudo, o MM continua a ser uma doença incurável e a resistência a fármacos é um dos fatores que compromete a sobrevivência destes doentes. Alterações em vários mecanismos moleculares têm sido relacionadas com a resistência adquirida a PIs, nomeadamente aumento de expressão de genes que codificam cadeias constituintes do proteasoma, presença de mutações do gene PSMB5 que codifica a cadeia do proteasoma responsável pelo passo crítico da catálise proteica, ativação de vias de autofagia, indução da atividade de proteínas de choque térmico, efluxo de fármacos por transportadores da superfamília ABC (ATP-binding cassette), indução da via de resposta antioxidativa NRF2, redução da diferenciação de plasmócitos pela via Xbp1, aumento da secreção de fatores de adesão celular na medula óssea e estimulação de vias de sobrevivência, como VEGF, NF-κB e IL-6. No entanto, a maioria desses marcadores moleculares estão reportados para a resistência a BTZ, havendo poucos estudos que evidenciem quais os fatores moleculares comuns aos três fármacos PIs que são atualmente utilizados na prática clínica.Este projeto pretendeu avaliar os mecanismos moleculares envolvidos na resistência aos PIs utilizados no tratamento do MM, averiguar o desenvolvimento de resistência cruzada entre os diferentes PIs e estudar formas de ultrapassar essa resistência.Desenvolveram-se três linhas celulares de MM resistentes a PIs, a partir da exposição contínua de uma linha celular sensível aos diferentes PIs (células NCI-H929) a doses não letais de BTZ (H929-BTZ), de CFZ (H929-CFZ) e de IXZ (H929-IXZ). A validação dos modelos resistentes e a avaliação da potencial resistência cruzada entre PIs foram avaliadas através do ensaio fluorométrico FMCA (fluorometric microculture cytotoxicity assay). A expressão de genes da via KEAP1/NRF2 (KEAP1 e NFE2L2), das subunidades REL e RELA constituintes do NF-κB e de transportadores do tipo ABC (ABCB1, ABCC1, ABCC2 e ABCG2) foi analisada por qPCR, nas linhas celulares sensível e resistentes. A expressão dos transportadores de efluxo da família ABC, P-gp, MRP1 e BCRP, foi analisada por citometria de fluxo por marcação à superfície com anticorpos conjugados com fluorocromos. Avaliou-se também a atividade desses transportadores de efluxo com recurso ao kit EFLUXX-ID® Green Multidrug Resistance, da Enzo Life Sciences. Os resultados foram analisados estatisticamente, considerando um nível de significância de 95%.Os resultados indicam que os modelos desenvolvidos de linhas celulares resistentes ao BTZ, CFZ e IXZ apresentam um IC50 5 vezes (×) (H929-BTZ 3,0 nM), 6× (H929-CFZ 1,9 nM) e 14× (H929-IXZ 20 nM) superior ao observado na linha celular sensível ao respetivo PI (BTZ 0,6 nM, CFZ 0,3 nM e IXZ 1,4 nM). Além disso, os modelos celulares H929-BTZ e H929-CFZ apresentam resistência cruzada entre os dois PIs, BTZ e CFZ, mas mantêm sensibilidade a IXZ. Contudo, as células do modelo H929-IXZ desenvolvem resistência cruzada a BTZ e a CFZ. A análise de marcadores moleculares expõe um papel relevante de transportadores de efluxo na resistência adquirida a PIs em células de MM. Esta resistência parece ser mediada pelos transportadores MRP1/2, que apesar de manterem os seus níveis de expressão membranar praticamente inalterados, a sua atividade nas células resistentes é superior ao observado na linha sensível. Adicionalmente, os genes ABCB1 e ABCG2 apresentam aumento de expressão nas células H929-CFZ (5,67E-3 ± 1,18E-3 e 3,09E-3 ± 3,90E-4, respetivamente) relativamente às células sensíveis (7,97E-4 ± 2,85E-4 e 3,14E-4 ± 2,54E-4, respetivamente), embora esse facto não se manifeste na expressão das proteínas na membrana celular.Em suma, células H929-BTZ, H929-CFZ e H929-IXZ desenvolvem resistência a BTZ e a CFZ. Mas ao passo que células H929-BTZ e H929-CFZ mantêm sensibilidade a IXZ, células H929-IXZ são resistentes a esse fármaco. Além disso, os nossos resultados sugerem que a resistência desenvolvida a PIs está relacionada com o aumento da atividade da MRP1/2. Estes resultados, se forem confirmados in vivo e transpostos para a prática, poderão alterar a abordagem terapêutica do doente com Mieloma múltiplo.

Multiple myeloma (MM) is a hematological neoplasm characterized by the proliferation of malignant plasma cells, which produce monoclonal immunoglobulins, and by the presence of myeloma-defining events. The knowledge of the molecular pathways involved in MM allowed the development of proteasome inhibitors (PIs) - bortezomib (BTZ), carfilzomib (CFZ) and ixazomib (IXZ), among other drugs aimed at molecular targets. However, MM remains an incurable disease and drug resistance is one of the factors that compromises the survival of these patients. Changes in several molecular mechanisms have been linked to acquired resistance to PIs, namely increased expression of genes encoding proteasome constituent chains, presence of mutations of the PSMB5 gene that encodes the proteasome chain responsible for the critical step of protein catalysis, activation of autophagy pathways, induction of heat shock protein activity, efflux of drugs by transporters of the ABC (ATP-binding cassette) superfamily, induction of the NRF2 antioxidative response pathway, reduction of plasma cells differentiation by the Xbp1 pathway, increased secretion of cell adhesion factors in the bone marrow and stimulation of survival pathways, such as VEGF, NF-κB and IL-6. However, most of these molecular markers are reported for resistance to BTZ, with few studies showing the molecular factors common to the three PI drugs that are currently used in clinical practice.This project intended to evaluate the molecular mechanisms involved in the resistance to PIs used in the treatment of MM, to investigate the development of cross resistance between different PIs and to study ways to overcome this resistance.Three PI-resistant MM cell lines were developed from the continuous exposure of a cell line sensitive to different PIs (NCI-H929 cells) to non-lethal doses of BTZ (H929-BTZ), CFZ (H929-CFZ) and IXZ (H929-IXZ). The validation of the resistant models and the evaluation of the potential cross-resistance between PIs were evaluated through the fluorometric FMCA assay (fluorometric microculture cytotoxicity assay). The expression of genes from the KEAP1/NRF2 pathway (KEAP1 and NFE2L2), from the REL and RELA subunits constituting the NF-κB and from ABC-type transporters (ABCB1, ABCC1, ABCC2 and ABCG2) was analyzed by qPCR, in sensitive and resistant cell lines. The expression of the ABC efflux transporters, P-gp, MRP1 and BCRP, was analyzed by flow cytometry by surface staining with antibodies conjugated to fluorochromes. The activity of these efflux transporters was also evaluated using the EFLUXX-ID® Green Multidrug Resistance kit, from Enzo Life Sciences. The results were analysed statistically, considering a 95% significance level.The results indicate that the developed models of cell lines resistant to BTZ, CFZ and IXZ present an IC50 5 times (×) (H929-BTZ 3.0 nM), 6× (H929-CFZ 1.9 nM) and 14× (H929-IXZ 20 nM) higher than that observed in the cell line sensitive to the respective PI (BTZ 0.6 nM, CFZ 0.3 nM and IXZ 1.4 nM). Besides that, cell models H929-BTZ and H929-CFZ have cross resistance between the two PIs, BTZ and CFZ, but maintain sensitivity to IXZ. However, H929-IXZ cells develop cross-resistance to BTZ and CFZ.The analysis of molecular markers exposes a relevant role of efflux transporters in the acquired resistance to PIs in MM cells. This resistance seems to be mediated by the MRP1/2 transporters, which despite maintaining their levels of membrane expression practically unchanged, their activity in resistant cells is higher than that observed in the sensitive line. Additionally, the ABCB1 and ABCG2 genes show increased expression in H929-CFZ cells (5.67×10-3 ± 1.18E-3 and 3.09E-3 ± 3.90E-4, respectively) for sensitive cells (7.97E-4 ± 2.85E-4 and 3.14E-4 ± 2.54E-4, respectively), although this does not manifest in the expression of proteins in the cell membrane.In short, H929-BTZ, H929-CFZ and H929-IXZ cells develop resistance to BTZ and CFZ. But while H929-BTZ and H929-CFZ cells maintain sensitivity to IXZ, H929-IXZ cells are resistant to this drug. In addition, our results suggest that the resistance developed to PIs is related to the increase in MRP1/2 activity. These results, if confirmed in vivo and translated into practice, could alter the therapeutic approach of the patient with Multiple myeloma.