Gene deletion and nanobodies strategies to target S100B and improve recovery in an ex vivo demyelinating model

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic neurodegenerative and autoimmune disease, characterized by inflammation and demyelination of the central nervous system (CNS). Altogether, these processes produce focal lesions in specific CNS regions, and depending on the affected region, different symptoms will appear, leading to an increase in both motor and cognitive disability, dependent on disease progression. Despite the enormous efforts done to unravel the mechanisms underlying MS pathology, the complex onset phenomenon might be due to an interplay of different factors, hampering the development of new therapeutics. The pursuit to found new biomarkers is extremely crucial, in order to find new different ways to tackle this disease. S100B is an inflammatory molecule that has been described as a major player in MS pathology. At physiological levels, S100B promotes differentiation and maturation of oligodendrocytes, required for the correct myelination of the CNS. Nevertheless, S100B has been found at high levels, in both cerebrospinal fluid and serum of MS patients at the diagnosis stage, as well in the active demyelinating lesions. This abnormal S100B overexpression was also detected in ex vivo demyelinating models, leading to microglia and astrocyte activation, exacerbating the neurodegenerative process. Recently, our group demonstrated that through S100B neutralization, a lower degree of demyelination, reactive gliosis, and also inflammation were obtained.First, in the present thesis we went further to analyse S100B neurotoxic effects using cerebellar organotypic slice cultures from three different mice. S100B heterozygotic and knockout mice demonstrated a decrease in demyelination as well as in inflammation, when compared to wild type mice, evidencing the neurotoxic effect of S100B when overexpressed. Afterwards, we tried to neutralize S100B using three different nanobodies. These small molecules possess several advantages such as extreme specificity to recognize unique epitopes, higher affinity, stability, and solubility than commonly used antibodies, as well as reduced immunogenicity. Interestingly, in the presence of these nanobodies, we observed a reduced degree of demyelination as well as a diminished inflammatory environment. Overall, our results emphasize the already described pejorative roles of S100B on MS pathophysiology, highlighting that S100B neutralization by the use of nanobodies, might be a promising therapeutic possibility regarding demyelinating and inflammatory diseases as is the case of MS.

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença crónica, neurodegenerativa e autoimune, caraterizada por processos inflamatórios e desmielinizantes no sistema nervoso central (SNC). Devido a estes processos, começam por aparecer lesões focais em certas regiões do SNC e, dependendo da região, podem surgir diferentes sintomas, resultando no aumento da incapacidade motora e cognitiva à medida que a doença evolui. Apesar dos inúmeros avanços a nível do conhecimento dos mecanismos subjacentes à complexa dinâmica patofisiológica desta doença, a mesma possui uma causalidade multifatorial que torna difícil o desenvolvimento de novas terapêuticas. Neste sentido, a procura de novos biomarcadores e alvos terapêuticos tem sido essencial para o desenvolvimento de novas estratégias para combater a EM. Tomando partido destes, vários avanços têm sido feitos na área da EM, como é o caso da molécula S100B. Em níveis fisiológicos, esta proteína promove a correta diferenciação e maturação de oligodendrócitos, necessários para a correta mielinização do SNC. No entanto, foram encontrados elevados níveis da proteína S100B tanto no soro como no líquido cefalorraquidiano de doentes com EM em fase de diagnóstico, estando também presente nas lesões ativas no SNC. Esta elevação de S100B é também detetada em modelos ex vivo de desmielinização, tendo sido demostrado que leva à ativação tanto de astrócitos como de células da microglia, potenciando o processo neurodegenerativo. Recentemente, o nosso grupo demonstrou que a neutralização desta proteína resultava num menor grau de desmielinização, de reatividade glial e consequentemente numa redução da resposta inflamatória. Desta forma na presente dissertação analisámos em primeiro lugar o efeito neurotóxico desta proteína, através da utilização de culturas organotípicas de cerebelo, provenientes de três linhagens de murganho, nos quais o gene para a S100B está alterado. Assim, através da comparação de culturas provenientes de murganhos expressando a S100B wild type, com as de heterozigóticos e ainda de homozigóticos com S100B knockout, foi possível notar uma diminuição tanto da desmielinização como da inflamação. Após a comprovação dos efeitos pejorativos desta proteína, procedemos à sua neutralização recorrendo a três Nanocorpos diferentes dirigidos para a S100B. A possibilidade do uso de Nanocorpos específicos para a S100B despertou a nossa curiosidade, devido às várias características vantajosas destas nanomoléculas, tal como a sua alta capacidade para reconhecer epítopos específicos, a sua maior estabilidade e solubilidade tal como uma imunogenicidade reduzida. A utilização dos Nanocorpos não só levou a uma diminuição da desmielinização, como também a um decréscimo do processo inflamatório. Desta maneira, estes resultados vêm reforçar o papel da S100B na patogénese desta doença e demonstrar que a sua neutralização, pelo uso de Nanocorpos específicos para esta proteína, constitui uma nova possibilidade terapêutica para doenças desmielinizantes inflamatórias como a EM.