The role of ageing in polyglutamine-induced neurodegeneration. A study in Machado-Joseph disease models

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD) or Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3) is an autosomal dominantly-inherited neurodegenerative disorder characterized by the pathological expansion of the CAG trinucleotide tract within the coding sequence of the ATXN3/MJD1 gene, conferring a toxic gain-of-function to the resulting mutant ataxin-3 protein. It belongs to the polyglutamine group of diseases, being the most common dominantly-inherited ataxia worldwide. The mutant protein leads to neuronal dysfunction and neurodegeneration in specific brain regions, with symptoms manifesting at midlife. Despite the significant research advances over the last years, the molecular mechanisms involved in MJD are still unclear and no treatment able to modify disease progression is available to patients. Ageing is the major risk factor for neurodegenerative disorders, being associated with the occurrence and progression of Alzheimer’s, Huntington’s and Parkinson’s disease, among others. Nuclear lamins and other proteins that are linked to homeostasis, have been shown to be altered not only in normal ageing, but also in neurodegenerative diseases. Furthermore, progerin, a mutated form of lamin A/C, responsible for the premature and accelerated ageing phenotype of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, constitutes a good model to study specific ageing characteristics. The main aim of this project was to investigate the role of ageing in MJD. In the first part of the work, detailed in chapter 2, we investigated the presence of age-related markers in MJD cellular (patient fibroblasts, N2a cells) and mouse models (transgenic and lentiviral models). A decrease in the protein levels of Lamins B1 and C, together with decreased Zmpste24 (involved in the maturation of lamin A) mRNA and protein levels was observed in the different MJD models. Moreover, we also observed nuclear circularity abnormalities, a hallmark of ageing, in the N2a MJD model, suggestive of an age-related phenotype. These results suggest that ageing might have a relevant role in MJD pathogenesis. To address the role of ageing in MJD degeneration, as detailed in chapter 3, we overexpressed progerin in a relevant brain area (the striatum) of a MJD lentiviral mouse model. Progerin overexpression aggravated MJD neuropathology, increasing loss of DARPP-32 expression, along with increased number of ubiquitinated aggregates. A tendency to increase the number of pyknotic nuclei was also seen, together with a significant increase in reactive astrogliosis. Taking all the above-mentioned evidences into account, we may infer that ageing may play an important role aggravating MJD pathogenesis and associated neuroinflammation. Finally, in chapter 4, having in mind that accelerating ageing aggravated the MJD- associated neuropathology, we further investigated whether this could be rescued by blocking progerin expression and delaying ageing in transgenic mice that recapitulates HGPS - Lmna G609G/ G609G, using the same strategy for the striatal MJD lentiviral model described in chapter 3, but using a shRNA targeting Lmna/progerin transcripts’ 3’UTR, together with mutant ataxin-3 lentiviral-induced expression. In this part of the work we were not able to detect any change in DARPP-32 depleted volume among the hemispheres as well as no alteration in mutant ataxin-3 aggregated protein levels. Given that the downregulation of progerin levels in this transgenic mouse model was limited, further studies are necessary to draw conclusions from this study In summary, this thesis provides strong evidences that ageing may have a relevant role in MJD, aggravating its associated neuropathological features. Delaying ageing, might be a possible strategy to delay neurodegeneration associated to MJD, a strategy for which more studies are needed.

A doença de Machado-Joseph (DMJ) ou Ataxia Espinocerebelosa de Tipo 3, é uma doença neurodegenerativa hereditária, autossómica dominante, caracterizada pela expansão patológica das repetições do trinucleótido CAG na região codificante do gene ATXN3/ MJD1, dando origem a uma proteína mutada, ataxina-3, com um ganho de função tóxico. Pertence ao grupo de doenças poliglutamínicas e é a ataxia hereditária dominante mais comum em todo o mundo. A proteína mutada leva a uma disfunção neuronal e neurodegenerescência em regiões específicas do cérebro, com sintomas que se manifestam na idade adulta. Apesar dos avanços científicos significativos nos últimos anos, os mecanismos moleculares envolvidos na DMJ ainda não estão totalmente esclarecidos e nenhum tratamento capaz de modificar a progressão da doença, está disponível para os doentes. O envelhecimento é o principal factor de risco para doenças neurodegenerativas, estando associado à ocorrência e progressão das doenças de Alzheimer, Huntington e Parkinson, entre outras. Já foi, no entanto, descrito que as laminas nucleares e outras proteínas que estão ligadas à sua homeostase, estão alteradas não só no envelhecimento fisiológico, mas também em doenças neurodegenerativas. Além disso, a progerina, uma forma mutada de lamina A/C, responsável pelo fenótipo de envelhecimento prematuro e acelerado da Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford (SPHG), permite estabelecer um bom modelo para estudar características específicas do envelhecimento. O principal objetivo deste projeto foi então investigar o papel do envelhecimento na DMJ. Na primeira parte do trabalho, detalhada no capítulo 2, investigámos a presença de marcadores associados ao envelhecimento em modelos celulares de DMJ (fibroblastos de doentes, células N2a) e modelos de murganho (modelos transgênico e lentiviral). Foram detectados níveis de proteína diminuídos das laminas B e C, juntamente com a diminuição dos níveis de mRNA e proteína da zmpste24 (envolvida na maturação da lamina A) nos diferentes modelos de DMJ. Por fim, também foram observadas irregularidades na circularidade nuclear, uma hallmark do envelhecimento, no modelo de N2a da DMJ, sugestivo de um fenótipo relacionado ao envelhecimento, resultados que indicam que o envelhecimento poderá ter um papel relevante na patogénese da DMJ. Na segunda parte deste projecto, no capítulo 3, o objectivo foi investigar o papel do envelhecimento na degenerescência associada à DMJ, sobre-expressando a progerina em regiões do cérebro relevantes (estriado) no modelo lentiviral da DMJ no murganho. A progerina agravou a neuropatologia associada à DMJ, aumentando a perda da expressão de DARPP-32, e simultaneamente promovendo o aumento do número de agregados ubiquitinados. Foi também observada uma tendência para aumento do número de núcleos picnóticos, juntamente com um aumento significativo na astrogliose reactiva. Tendo em consideração todas as evidências mencionadas, podemos inferir que o envelhecimento poderá ter um papel importante no agravamento da patogénese associada à DMJ, incluindo a neuroinflamação. Finalmente, no capítulo 4, após concluirmos que a aceleração do envelhecimento agravou a neuropatologia associada à DMJ, quisemos investigar se esse efeito poderia ser resgatado/revertido, bloqueando a expressão de progerina, desta forma retardando o envelhecimento em murganhos transgénicos que recapitulam o SPHG - Lmna G609G/ G609G. Para o efeito, recorremos ao modelo lentiviral estriatal de DMJ descrito no capítulo 3, mas neste caso, em conjunto com a indução da expressão ataxina-3 mutada silenciámos a Lmna / progerina com shRNAS codificados por vectores lentivirais. Nesta parte do trabalho, não foi possível detectar qualquer alteração no volume de perda de DARPP-32 entre os hemisférios dos animais, nem alteração nos níveis de proteína agregada de ataxina-3. Dado que a redução dos níveis de progerina no modelo transgénico de SPHG foi limitada serão necessários mais estudos para se poderem tirar conclusões sobre esta parte do trabalho. Em resumo, nesta tese apresentamos fortes evidências de que o envelhecimento poderá ter um papel relevante na DMJ, agravando as suas características neuropatológicas associadas, pelo que retardar o envelhecimento, poderá ser uma estratégia possível para atrasar a neurodegenerescência associada à DMJ.