Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/90446
Title: Caraterização celular e molecular dos efeitos da radiação em neoplasias - Estudo experimental em linfoma e carcinoma do pulmão de pequenas células
Authors: Mendes, José Figueiredo Agostinho D`Abreu Mendes
Orientador: Rosa, Manuel Santos
Botelho, Maria Filomena
Ribeiro, Ana Bela Sarmento
Keywords: Radioterapia; Radiação ionizante; Cancro do pulmão; Linfoma difuso de grandes células B; Stresse Oxidativo; P53; Morte celular; Sistema imune; Radiotherapy; Ionizing radiation; Lung cancer; Large diffuse B cell Lymphoma; Oxidative stress; Cell cycle; Cell death; P53; Immune system
Issue Date: 13-Jul-2016
Abstract: A radioterapia é uma das modalidades de tratamento mais comummente utilizada para o tratamento do cancro, tanto de tumores sólidos como de tumores com origem hematopoiética. O cancro do pulmão é um tumor sólido, com uma das taxas de incidência e de mortalidade mais elevadas em todo mundo. O linfoma difuso de grandes células B é um tumor hematopoiético e o tipo mais comum de linfoma- não Hodgkin. Este trabalho teve como um dos objetivos determinar e caraterizar os efeitos intracelulares da radioterapia em linhas celulares de cancro do pulmão de pequenas células (H69) e de não pequenas células (A549 e H1299) e de linfoma difuso de grandes células B (Farage). Para este propósito, foram determinados os efeitos da radiação ionizante na viabilidade, na proliferação, na sobrevivência e nos mecanismos de morte celular. Realizaram-se os ensaios do azul tripano, do Alamar Blue®, clonogénico, estudos de citometria de fluxo, através da dupla marcação com anexina V e com iodeto de propídeo, da marcação das proteínas BAX e BCL-2, das alterações no potencial de membrana mitocondrial e estudos de morfologia celular com a coloração May-Grünwald Giemsa. Para além disto, foram também avaliados, por citometria de fluxo, os efeitos da radiação ionizante no stresse oxidativo, no que respeita à produção intracelular de peróxidos, de radical superóxido e da defesa anti-oxidante glutationa reduzida. Os danos no DNA foram determinados pelo ensaio cometa, e a expressão da proteína P53 total e fosforilada foi avaliada por western blot. Paralelamente constituiu outro objetivo deste trabalho a avaliação dos efeitos da radioterapia no sistema imunitário de doentes com cancro do pulmão e com linfoma difuso de grandes células B. Para a concretização deste objetivo foram incluídos neste estudo 8 doentes de cancro do pulmão e 9 doentes de linfoma difuso de grandes células B. Após a colheita de sangue periférico foram determinadas as contagens leucocitárias pela realização de um leucograma, as contagens linfocitárias e das células T reguladoras com recurso a Lymphogram® e imunofenotipagem, respetivamente. Foram ainda avaliadas trinta e quatro citocinas e quimiocinas, relevantes na resposta do sistema imunitário, através do kit comercial ProcartaPlexTM Immunoassay Magnetic Beads. A radiação ionizante induziu diminuição da proliferação, da viabilidade e da sobrevivência celular em todas as linhas celulares. No entanto, a sobrevivência ajustou-se a modelos de agressão celular distintos. Enquanto as linhas celulares H1299 e Farage apresentaram uma resposta correspondente que se ajustou ao modelo linear quadrático, as linhas celulares H69 e A549 apresentaram uma resposta correspondente ao modelo de um só alvo um só toque, portanto, ao modelo linear. Após exposição à radiação ionizante, o tipo de morte celular preferencial foi dependente da dose e, presumivelmente, do perfil de expressão de P53. Assim a expressão P53Wild, das células Farage e A549, foi associada a morte celular por apoptose, enquanto a ausência de expressão, verificada nas células H1299, e a produção de uma proteína mutada, descrita nas H69, foi associada a morte celular por necrose, particularmente com as doses mais elevadas. Além disso, nas linhas celulares Farage e A549 os níveis de expressão da proteína P53 com a irradiação tanto no que respeita à proteína total como à forma fosforilada aumentam. De forma complementar verificou-se que a despolarização de membrana mitocondrial e o aumento da razão BAX/BCL-2 indicam que a morte celular por apoptose, típica das células P53Wild, parece ser ativada pela via intrínseca. Relativamente ao ciclo celular verificou-se bloqueio nas fases G0/G1 e na fase S nas linhas celulares Farage e A549 enquanto as linhas celulares H1299 e H69 progrediram nas referidas fases mas ficaram comprometidas mais tardiamente na fase G2/M. Estes dados reforçam a importância do perfil molecular na resposta à radiação ionizante. Finalmente, o stresse oxidativo e os danos no DNA destacaram-se como processos de grande importância associados aos efeitos da radiação ionizante. Paralelamente, o estudo de patologia humana realizado no âmbito desta Tese revelou que a resposta do sistema imunitário ao tratamento por radioterapia foi dependente do tipo de cancro em estudo. A avaliação do leucograma dos doentes com cancro do pulmão evidenciou alterações nos leucócitos, linfócitos e monócitos a meio do tratamento com radioterapia. No entanto, não se observaram diferenças significativas no leucograma dos doentes com linfoma difuso de grandes células B. Do mesmo modo, nos doentes com cancro do pulmão observaram-se alterações no linfograma no que respeita às células B, às células Natural Killer e às células Natural Killer citotóxicas. Por outro lado, nos doentes com linfoma difuso de grandes células B verificaram-se alterações a nível das células T reguladoras induzidas. Relativamente às citocinas e às quimiocinas associadas ao perfil Th1 destacou- se o aumento da concentração de interferão γ nos doentes com linfoma difuso de grandes células B. Os doentes com cancro do pulmão apresentaram um perfil Th1 mais acentuado do que os doentes com linfoma difuso de grandes células B, o que se concluiu pelos níveis superiores de IL-2, de INF-γ e de IL-1β. Paralelamente, o perfil Th2 caracterizou-se pela maior concentração de IL-5, no sangue periférico dos doentes com linfoma difuso de grandes células B. Finalmente, destacou-se o aumento da concentração de IL-27 e de IL-7 nos doentes com cancro do pulmão. Com este trabalho foi possível concluir que a resposta à radioterapia é dependente das caraterísticas celulares e moleculares das células tumorais em estudo. O melhor conhecimento e compreensão das caraterísticas moleculares do tumor e dos mecanismos de resposta ao tratamento constituem uma mais-valia na decisão terapêutica e na avaliação do prognóstico. Para além disto, o microambiente tumoral, bem como a atuação do sistema imunitário sobre células tumorais no contexto da radioterapia, podem condicionar a resposta à terapêutica e a sobrevivência a longo termo.
Radiotherapy is one of the most common modalities used for treating both solid tumors and hematopoietic origintumors. Lung cancer is a solid tumor, with on of the higher incidence and mortality rates worldwide. Diffuse large B-cell lymphoma is a hematopoietic tumor being the most common type of lymphoma non-Hodgkin. One of the aims of this work was to determine and characterize the intracellular effects of radiotherapy in cell lines of small cell lung cancer (H69), non-small cell lung cancer (A549 and H1299) and diffuse large B cell lymphoma (Farage). For this purpose, we determined the effects of ionizing radiation on viability, proliferation, survival and cell death mechanisms. For this, trypan blue assay, Alamar Blue® assay, clonogenic studies, flow cytometry studies, using the double staining with Annexin V and propidium iodide, labelling BAX and BCL-2 proteins, alteration of mitochondrial membrane potential, and cell morphology studies, with May Grünwald-Giemsa staining, were performed. Furthermore, we also evaluated by flow cytometry, the effects of ionizing radiation in the oxidative stress regarding production of intracellular peroxides, superoxide radicals and of the anti-oxidant defense glutathione. The DNA damage was determined by the comet assay, and the expression of phosphorylated and total P53 protein was assessed by Western blot. Alongside, another aim of this study was to evaluate the effects of radiation on the immune system of patients with lung cancer and with diffuse large B cell lymphoma. To achieve this goal eight lung cancer patients and nine diffuse large B cell lymphoma patients were included in this study. After collecting peripheral blood, leukocyte counts were determined as well as the lymphocyte counts and the regulatory T cells using the Lymphogram® and immunophenotyping, respectively. We also evaluated thirty four cytokines and chemokines relevant to the response of the immune system through the commercial kit ProcartaPlex™ Immunoassay Magnetic Beads. Ionizing radiation induced a decrease in proliferation, viability and cell survival in all cell lines. However, survival was adjusted to different cellular injury models. While H1299 and Farage cell lines had a response that correspondes to the linear quadratic model, H69 and A549 cell lines showed a response set to the model of one touch one target, íe the linear model. After exposure to ionizing radiation, the preferred type of cell death observed was dose dependent and, presumably, P53 profile expression dependent. Thus, expression of P53Wild in Farage and A549 cells was associated with cell death by apoptosis while no P53 expression observed in H1299 cells, and production of a mutated protein, described for H69, was associated with cell death by necrosis, particularly at higher doses. In addition, the A549 and Farage cell lines the level of P53 protein and of phospohorilated P53 protein augmented. Complementarily, the depolarization of the mitochondrial membrane potential and the increase in BAX/BCL-2 ratio indicates that cell death by apoptosis, typical of P53Wild cells, seem to be activated by the intrinsic pathway. For the cell cycle a blockage in G0/G1 and S phase was observed in A549 and in Farage cell lines while H69 and H1299 cell lines progressed in these phases but were compromised later in G2/M phase. These findings underscore the importance of the molecular profile in response to ionizing radiation. Finally, the oxidative stress and DNA damage stood out as very important processes in the effects of ionizing radiation. Parallelly, the study of human pathology performed within this Thesis revealed that the immune system response to radiotherapy was dependent on cancer type. The assessment of leucocyte cout of lung cancer patients showed changes in leukocytes, lymphocytes and monocytes during treatment with radiation. However, no significant differences in leucocytes were found in diffuse large B cell lymphoma patients. Similarly, in lung cancer patients changes were observed in limphogram with respect to B cells, Natural Killer cells and cytotoxic Natural Killer cells. Furthermore in patients with diffuse large B cell lymphoma there were changes in the induced regulatory T cells. Regarding cytokines and chemokines associated with Th1 profile, we observed an increase in interferon-γ concentration in diffuse large B cell lymphoma patients. Lung cancer patients showed a stronger Th1 profile than patients with diffuse large B cell lymphoma, which is confirmed by the higher levels of IL-2, INF-γ and IL-1β. In parallel, the Th2 profile was characterized by the highest concentration of IL-5 in the peripheral blood of diffuse large B cell lymphoma. Finally, there was an increase in IL-27 concentration and in IL-7 in lung cancer patients. We can concluded that the response to radiation is dependent on the cellular and molecular characteristics of the tumor cells under study. Better knowledge and understanding of the molecular characteristics of the tumor and mechanisms of response to treatment is an asset concerning the therapeutic decision and prognosis evaluation. In addition, tumor microenvironment, as well as the activity of the immune system on tumor cells in the context of radiotherapy, may contribute to better therapeutic outcome and survival in the long term.
Description: Tese de Doutoramento do Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde, ramo de Tecnologias da Saúde, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/90446
Rights: openAccess
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