Antimicrobial residues in aquaculture species for human consumption: analytical determination and assessment of related public health hazards

Abstract

The production of animals intended for human consumption, including aquaculture, is nowadays strongly anchored in the use of antibacterials. These drugs aim to treat but mainly, and particularly in the aquaculture industry, to prevent the emergence and rapid spread of infectious diseases, which can compromise entire production batches. Aquaculture is probably the fastest growing food-producing sector, accounting nowadays for nearly 50 % of the world’s food fish supply for human consumption, and this share is projected to rise to 62% by 2030 as catches from wild capture fisheries level off and demand from a progressively growing world population substantially increases. This exponential growth is associated with the implementation of intensive and semi-intensive production methods and is hampered by unpredictable mortalities that may be due to negative interactions between fish and pathogenic bacteria. The use of antibiotics, to prevent these losses, is the commonly adopted solution, not always according to good practices and regulatory and scientific specifications. The use of antimicrobials in fish intended for human consumption may lead to the presence of residues of the parent compound, and also their metabolites and by-products, in edible parts of the animal, and the risk increases if such antimicrobials are used inappropriately, for example, in an untargeted manner (e.g. mass medication or use on non-susceptible microorganisms), at sub-therapeutic doses, repeatedly, or for inappropriate periods of time. There are two major concerns arising from these practices related to their effect on consumers' health. First of all, the presence of antimicrobial residues in edible tissues that, in persistent low doses, become part of the consumers' diet, and may also trigger toxic effects in hypersensitive individuals. Secondly, of no less importance, it contributes to the emergence, spread and transference of antimicrobial resistance determinants, which represents nowadays a huge threat to public health worldwide. In order to protect consumers’ health, the European Commission established maximum residue limits for veterinary medicinal products in edible products from animal origin, set performance criteria for the analytical methods employed in official residues control and requires Member States to adopt and implement a national residue monitoring plan for specific groups of residues. The aim of our work is the development and validation of analytical methodologies, according to the European Commission specifications’, for the detection and quantification of antibacterials in aquaculture farmed species, namely in gilthead sea bream, European sea bass and salmon, using multi-residue and multiclass methods, and the subsequent application of those methodologies in real samples purchased in the Portuguese retail market. In the first chapter – The use of antimicrobials in aquaculture – a bibliographic review is presented on the major aspects regarding current practices and antimicrobials’ usage profile in aquaculture industry, legal framework, and public health hazards related to the presence of antimicrobial residues in food. The second chapter reviews the most recent analytical methodologies concerning the determination of antimicrobial residues in fish, reported in the literature, given emphasis on sample procedures, extraction/purification methods, chromatographic conditions and validation techniques according to legislation. The third chapter describes the application of a validated multiclass multi-residue ultra-high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry in tandem methodology for the determination of 41 antibiotics, from seven different classes, in 29 samples of gilthead sea bream of aquaculture origin, purchased in Portugal. The fourth chapter describes the development and validation of a multiclass multi-residue method for the simultaneous detection and determination of antibacterials in European sea bass muscle. The method was based on ultra-high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), and proved to be a rapid, highly selective and sensitive tool, requiring minimum sample preparation, for the screening and detection of 47 compounds from eight different classes. The method was applied in 30 samples of farmed European sea bass purchased in different supermarkets in Portugal The fifth chapter describes the development and validation of a fast and sensitive multi-residue and multiclass screening method, for the simultaneous determination of 44 antimicrobials in salmon muscle, from seven different classes, using ultra-high-performance liquid chromatography-time-of-flight-mass spectrometry (UHPLC-ToF/MS). The method was validated, in accordance with Commission Decision 2002/657/EC, and all the compounds were successfully detected and identified at concentration levels corresponding to ½ maximum residue limit. As in the previous chapters, the validated screening methodology was applied in 39 real samples of farmed salmon purchased in Portugal. The importance of rapid, sensitive and robust techniques for the screening of antibacterial residues in farmed fish is discussed in the sixth chapter – General Discussion – along with the discussion on the results obtained for our real samples and the importance of reducing the use of these drugs in aquaculture industry, bearing in mind the public health perspective. Finally, in the last chapter, the distinctive characteristics of the developed and validated methods are highlighted, stressing the need of improvement of these methods, namely by the inclusion of other relevant antimicrobials. Also, it was concluded that an urgent reflexion needs to be undertaken, leading to concrete and major changes in the food producing industry, regarding the use of antimicrobials.

A produção de animais destinados ao consumo humano, incluindo a aquacultura, está hoje em dia fortemente alavancada na utilização de antibióticos. Estes fármacos destinam-se ao tratamento e prevenção de doenças infecciosas, muito particularmente na indústria da aquacultura, para evitar a emergência e rápida propagação da infeção. De facto, a aquacultura é hoje em dia a indústria de produção alimentar com crescimento mais acentuado, contribuindo para cerca de 50% do total de abastecimento de peixe para consumo humano, estimando-se que este valor atinja os 62% em 2030, na medida em que a captura de peixe está progressivamente a diminuir e a procura por parte dos consumidores a aumentar. Este crescimento exponencial da aquacultura decorre da implementação de sistemas de produção intensivos e semi-intensivos, estando fortemente condicionada por imprevisíveis índices de mortalidade das espécies devido a interações prejudiciais entre o peixe e microrganismos patogénicos. A utilização de antibióticos para prevenir estas perdas é uma solução comumente usada pelos produtores, ainda que nem sempre de acordo com as boas práticas e as especificações científicas e regulamentares. A utilização de antimicrobianos na produção de peixe destinado ao consumo humano pode resultar na presença de resíduos do fármaco original, ou dos seus metabolitos, em partes edíveis do animal, e o risco aumenta quando estes fármacos são usados de forma inapropriada, como por exemplo quando são utilizados de forma cega (e.g. administração em massa a todos os animais da produção ou uso para tratamento de infeções causadas por microrganismos não sensíveis), em concentrações sub-terapêuticas, de forma repetida ou por períodos de tempo inapropriados. Estas práticas suscitam duas grandes preocupações, relacionadas com os efeitos na saúde dos consumidores. Em primeiro lugar, a presença de resíduos do fármaco em tecidos edíveis do animal que, em baixas doses, mas persistentemente, integram a dieta habitual dos consumidores, podendo igualmente despoletar efeitos tóxicos em indivíduos particularmente sensíveis. Em segundo lugar, e não menos importante, esta prática contribui para a emergência, transferência e disseminação de determinantes de resistência microbiana aos antibióticos, que hoje em dia é unanimemente reconhecida como um problema de saúde pública à escala global. No sentido de proteger a saúde dos consumidores, a Comissão Europeia estabeleceu limites máximos de resíduos para medicamentos veterinários, em tecidos edíveis de origem animal, bem como definiu critérios de desempenho para os métodos analíticos empregues no controlo oficial de resíduos, requerendo aos Estados Membros a adoção e implementação de planos nacionais de pesquisa para determinados grupos de resíduos. O nosso trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e validação de metodologias analíticas, de acordo com as especificações emanadas da Comissão Europeia, para a deteção e quantificação de resíduos de antibacterianos em espécies de aquacultura, nomeadamente a dourada, o robalo e o salmão, usando metodologias de determinação multi-classe e multi-resíduo, bem como a aplicação destas metodologias a amostras reais adquiridas no comércio de venda a retalho em Portugal. No primeiro capítulo – A utilização de antibióticos em aquacultura – é apresentada uma revisão bibliográfica centrada nos aspetos mais relevantes relacionados com as práticas atuais e perfil de utilização de antibióticos na indústria da aquacultura, o enquadramento legislativo, bem como os potenciais riscos para a saúde humana associados à presença de resíduos de antibióticos em alimentos. No segundo capítulo, é feita uma revisão das mais recentes metodologias analíticas para a determinação de resíduos de antimicrobianos em peixes, com destaque para a preparação da amostra, métodos de extração/purificação, condições cromatográficas e validação das técnicas, em conformidade com a legislação. O terceiro capítulo descreve a utilização de uma metodologia validada, por cromatografia líquida de elevada eficiência acoplada a detetor de massa sequencial, para a determinação de 41 antibióticos de 7 classes diferentes em 29 amostras de dourada de aquacultura adquiridas em Portugal. O quarto capítulo descreve o desenvolvimento e validação de um método multi-resíduo e multi-classe para a determinação simultânea de antibióticos em músculo de robalo. O método baseou-se em cromatografia líquida de elevada eficiência acoplada a detetor de massa sequencial (UHPLC-MS/MS), tendo demonstrado características de rapidez de execução, elevada seletividade e sensibilidade, requerendo procedimentos mínimos de preparação da amostra, para a triagem e deteção de 47 moléculas antibacterianas, de 8 classes diferentes. O método foi aplicado em 30 amostras de robalo de aquacultura, adquiridos em diferentes supermercados em Portugal. O capítulo 5 descreve o desenvolvimento de um método de rastreio multi-resíduo e multi-classe, rápido e sensível, para a determinação simultânea de 44 antibióticos em músculo de salmão, utilizando cromatografia líquida de elevada eficiência acoplada a detetor de massa com analisador por tempo de voo (UHPLC-ToF/MS). O método foi validado, em conformidade com a Decisão da Comissão 2002/657/EC, e todos os compostos foram detetados e identificados a níveis de concentração correspondentes a ½ do limite máximo de resíduo permitido. Tal como nos capítulos anteriores, a metodologia validada foi aplicada a 39 amostras de salmão de aquacultura, adquiridos em supermercados portugueses. A importância de dispor de técnicas de determinação céleres, sensíveis e robustas, para o rastreio de antibióticos em peixes de aquacultura é discutida no sexto capítulo, juntamente com a discussão dos resultados obtidos na análise das amostras reais das 3 espécies adquiridas no mercado português, bem como a importância de reduzir a utilização destes fármacos na indústria de produção de pescado, tendo em consideração a preservação e a salvaguarda da saúde dos consumidores. Finalmente, no último capítulo, as características diferenciadoras dos métodos desenvolvidos e validados são realçadas, sublinhando-se a necessidade de melhoria deste tipo de métodos, nomeadamente no sentido da inclusão de outras classes de antibióticos de relevo. Adicionalmente, conclui-se pela necessidade de ser promovida uma reflexão urgente, que conduza a mudanças estruturais e concretas na indústria de produção alimentar, concretamente no que se refere à utilização de antibióticos.