Assessing the safety profile of biodegradable poly(ε-caprolactone) implants - effect in microglia-mediated neuroinflammation

Abstract

O glaucoma é uma doença degenerativa crónica e progressiva da retina, caracterizada por degenerescência do nervo ótico e morte de células ganglionares da retina, sendo uma das principais causas de cegueira irreversível a nível mundial.A pressão intraocular elevada é um dos principais fatores de risco, sendo que o objetivo do tratamento é a redução da pressão intraocular. No entanto, os tratamentos existentes proporcionam eficácia limitada, uma vez que muitos pacientes continuam a perder a visão apesar do sucesso em controlar a pressão intraocular. Portanto, são necessários novos tratamentos mais eficazes, e a proteção das células ganglionares da retina é considerada uma estratégia com potencial no tratamento desta doença. A neuroinflamação desempenha um papel importante na fisiopatologia do glaucoma, sendo as células da microglia ativadas um dos intervenientes no processo neurodegenerativo.A ativação do receptor A3 de adenosina (A3R), um receptor acoplado a proteínas G, confere proteção à retina, incluindo às células ganglionares da retina, contra vários insultos, revelando a possibilidade de uma nova estratégia para o tratamento do glaucoma com foco na neuroproteção das células ganglionares da retina. No entanto, sendo o glaucoma uma doença crónica, a administração local do agonista do A3R por injeção intravítrea exigiria injeções múltiplas, o que apresenta várias desvantagens e efeitos colaterais. Para superar estas limitações, sistemas de libertação sustentada de fármacos têm sido desenvolvidos; tais sistemas podem atingir concentrações terapêuticas prolongadas de fármacos nos tecidos alvo , limitando a exposição sistémica e os efeitos secundários. A fim de reduzir os potencias efeitos secundários do 2-Cl-IB-MECA (agonista seletivo do A3R) e aumentar o seu tempo de permanência, o potencial uso de um implante poroso baseado em poli-caprolactona (PCL) com 2-Cl-IB-MECA na neuroproteção de células ganglionares da retina está a ser estudado pelo nosso grupo em modelos experimentais de glaucoma. Neste contexto, é importante avaliar se a presença de implantes baseados em PCL induz uma reação inflamatória adversa, uma vez que a inflamação contribui para a neurodegenerescência na retina.O objetivo principal deste projeto foi perceber se os produtos resultantes da degradação de implantes preparados a partir de PCL desencadeiam reatividade das células da microglia, as células imunes do sistema nervoso central. Além disso, pretendeu-se também estudar os efeitos da ativação do A3R na reatividade das células da microglia induzida por pressão hidrostática elevada (EHP), uma vez que o objetivo a longo termo do projecto é preparar um implante contendo o agonista do recetor e é importante conhecer os efeitos da ativação deste recetor em contexto de doença.A exposição de células BV-2 a produtos de degradação do implante não afetou a viabilidade celular nem causou morte celular. Além disso, não alterou a imunorreatividade da isoforma idutível da sintase do monóxido de azoto (iNOS), nem os níveis de fator de necrose tumoral (TNF).A produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) também não foi alterada em culturas purificadas de microglia quando expostas a meio que esteve em contacto com o implante. Além disso, a espessura da retina, o número de células ganglionares da retina e a reatividade das células da microglia não foram afetadas pelos produtos de degradação do implante. A ativação do A3R diminuiu a expressão da iNOS, migração e fagocitose induzida por EHP em células BV-2. Em culturas purificadas de microglia, a proliferação e fagocitose induzidas por EHP também foram diminuídas. Curiosamente, bloqueio do A3R também diminuiu a expressão da iNOS e a fagocitose induzidas por EHP em células BV-2, assim como a proliferação das células da microglia da retina.Em resumo, os nossos resultados demonstraram que a degradação do implante à base de PCL não provocou reatividade das células da microglia, indicando que seria provavelmente bem tolerado quando introduzido no vítreo. Além disso, a ativação do A3R, controlou algumas características da reatividade da microglia, sugerindo que os agonistas do A3R podem ter propriedades protetoras para o tratamento do glaucoma baseado no controlo da neuroinflamação.

Glaucoma is a progressive chronic retinal degenerative disease and a leading cause of global irreversible blindness, characterised by optic nerve damage and retinal ganglion cell (RGC) death. Elevated intraocular pressure (IOP) an important risk factor in glaucoma, and the mainstay of the treatment is IOP lowering. However, the existing treatments provide limited effectiveness, as many patients continue to lose vision despite successful IOP control. Therefore, new and more effective treatments are necessary, and neuroprotection of RGCs is considered to offer potential as an additional therapy. Neuroinflammation plays an important role in glaucoma pathophysiology, being activated microglia one of the main players of the neurodegenerative process.The activation of adenosine A3 receptor (A3R), a G protein-coupled receptor, affordsprotection to the retina, including RGCs, against a wide range of insults, unveiling the possibility for new strategy for glaucoma treatment focusing on RGC neuroprotection. Nevertheless, the local delivery of the A3R agonist by intravitreal injection would require multiple injections since glaucoma is a chronic disease, which may carry several disadvantages and side effects. Sustained-release drug delivery systems have been developed to overcome these limitations; such systems can achieve prolonged therapeutic drug concentrations in ocular target tissues while limiting systemic exposure and side effects. In order to bypass the potential side effects of systemic administration and the multiple intravitreal injections of 2-Cl-IB-MECA (selective agonist of A3R), we are studying a porous poly-ε-caprolactone (PCL)-based implant loaded with 2-Cl-IB-MECA in the neuroprotection of RGCs in experimental models of glaucoma. In this context, it is important to assess whether the presence of PCL-based implants elicit an inflammatory adverse reaction, since inflammation mediates neurodegeneration in the retina.The main aim of this project was to study whether implants prepared from PCL trigger reactivity of microglial cells, the immune cells of the central nervous system. Since the long- term purpose of this project is to prepare an implant loaded with the A3R agonist, and it is important to know the consequences of the receptor activation in a pathological context, we studied the effects of A3R activation in the reactivity of microglia triggered by the exposure to elevated hydrostatic pressure (EHP), used to mimic elevated IOP.The exposure of BV-2 microglial cells to PCL-based implant degradation products did not affect microglial viability or cell death, and did not increase inducible nitric oxide synthase (iNOS) immunoreactivity or tumor necrosis factor (TNF) levels. Reactive oxygen species (ROS) production was also not altered in retinal microglia when exposed to medium that was in contact with the implant. Moreover, retinal thickness, RGC number and microglia reactivity were not affected by the degradation products of the PCL-based implant. The activation of the A3R reduced EHP-induced iNOS expression, microglia migration and phagocytosis in BV-2 cells. In retinal microglia, proliferation and phagocytosis elicited by EHP were also decreased by A3R activation. Interestingly, the blockade of A3R also reduced EHP- induced iNOS expression and phagocytosis in BV-2 cells, and proliferation in retinal microglia.In summary, our results demonstrated that the degradation of the PCL-based implant did not elicit microglia reactivity, indicating that it would be well tolerated by the host immune system. Moreover, the activation of the A3R was able to control some features of microglia reactivity, suggesting that A3R agonists could also afford protection against glaucomatous degeneration through the control of neuroinflammation.