Characterization of the postsynaptic density in a transgenic mouse model of Huntington’s disease

Abstract

Huntington's disease (HD) is a progressive, autosomal dominant neurodegenerative disease that selectively affects the striatum and lately the cortex. HD is characterized by early psychiatric abnormalities and subtle cognitive changes, uncontrolled motor impairment and progressive dementia. The disease is caused by the expression of the huntingtin mutant (mHTT), a ~350 kDa protein containing N-terminal polyglutamine stretch due to an expansion of CAG repeats in the exon 1 of the HTT gene. mHTT interferes with several cellular mechanisms that lead to mitochondrial and synaptic dysfunction, among several other cellular pathways. Interestingly, postsynaptic SAPAP3, a protein highly expressed in striatum, was previously associated with psychiatric behavior. However, mHTT-induced changes of selective proteins at the postsynaptic density (PSD) has been poorly described. Thus, in this project we aimed to characterize striatal and cortical PSD proteins, as well as VDAC1 (a mitochondrial protein), at PSDs, considering the possible presence of mitochondria at glutamatergic dendritic spines. For this purpose, we isolated brain lysates (BL), synaptic plasma membranes (SPMs), that are devoid of organelles from the internal environment of the nerve terminal, and PSDs from the striatum and cerebral cortex of YAC128 transgenic mouse model (expressing full-length human mHTT) versus WT mice at early (3 month-old, mo) and late (9-12 mo) stage, and postmortem human brain caudate derived from HD patients and control individuals. In BLs, results indicate unchanged levels of synaptophysin in 3 mo striatum and 3 mo and 9-12 mo cortex from YAC128 compared to WT mice; preliminary data in striatum 9-12 mo YAC128 vs WT suggest a decrease in synaptophysin protein levels. In SPMs, our results showed a tendency for an increase, in protein levels of neuroligin-3 in 3 mo striatal SPMs, however no changes were detected in cortical 3mo and 9-12mo SPMs. Actin protein levels remained unchanged in both brain regions at 3 mo and 9-12 mo SPMs. Data show a significant decrease in SAPAP3 levels in PSDs isolated from HD patient’s caudate and from 3 mo YAC128 mouse striatum, but not the cortex. However, no changes in SAPAP3 mRNA levels were observed in the striatum or cortex of YAC128 mice. PSD-95 and Homer also decreased in HD patient’s PSDs. No changes in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor (NMDAR) subunits, namely GluN1, GluN2A or GluN2B, were observed in YAC128 mouse striatal PSDs; nevertheless, reduced GluN1 proteins levels, and a tendency for a decrease in GluN2A and GluN2B were detected in the 9-12 mo YAC128 mouse cortical PSDs. Further characterization of striatal PSDs obtained from YAC128 mice showed a decrease in actin and an increase in Homer levels in 3 mo YAC128 mice; in contrast, cortical PSDs showed a decrease in Sorbs2 in 3 mo YAC128 mice and a tendency for a decrease in Homer in 9-12 mo YAC128 mice. PSDs from the HD human caudate exhibited a decrease in Homer levels, but unchanged actin levels. In addition, we provide evidence for mitochondrial VDAC1 protein in both human caudate and striatal and cortical mouse brain isolated PSDs; decreased VDAC1 levels were observed in the caudate of HD patients and a tendency for a decrease in 9-12 mo YAC128 mouse striatal and cortex PSDs. A possible direct interaction between HTT or mHTT with PSD proteins in YAC128 and WT striatum was also addressed in this study. Preliminary data indicate that there is no interaction between HTT (WT or mutant forms) and SAPAP3, Homer or Shank3 proteins. In conclusion, the present study shows early decreased SAPAP3 and actin, but enhanced Homer in YAC128 mouse striatal PSDs suggesting that these proteins may constitute markers for early symptomatic HD. Conversely, NMDAR subunits (in cortex) and VDAC1 (striatum and cortex) seem to be highly affected at late symptomatic stage of the disease. Although more studies will be required to establish the precise influence of mHTT on glutamatergic cortico-striatal synapses, this study is a stepping stone that contributes to an overall view of protein changes in HD and their possible relevance in defining HD-related behavior.

A doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante progressiva, que afeta seletivamente o estriado e, posteriormente, o córtex. A DH é caracterizada por alterações psiquiátricas e modificações cognitivas subtis, disfunção motora e demência progressiva. A DH é causada pela expressão da huntingtina mutante (mHTT), uma proteína que contém uma extensão de poliglutaminas no terminal amímico devido a uma expansão de repetições CAG no exão 1 do gene HTT. A mHTT interfere com vários mecanismos celulares, que conduzem à disfunção mitocondrial e sináptica, entre outras vias celulares. Curiosamente, a SAPAP3, uma proteína pós-sináptica altamente expressa no estriado, foi previamente associada ao comportamento psiquiátrico. No entanto, alterações seletivas de proteínas da densidade pós-sináptica (PSD) mediadas por mHTT têm sido pouco descritas. Assim, neste projeto pretendemos caracterizar as proteínas da PSD no estriado e córtex, bem como a VDAC1, uma proteína mitocondrial, considerando a possível presença de mitocôndrias em espículas dendríticas glutamatérgicas. Assim, neste estudo obtivemos, do inglês “brain lysates” (BL), do inglês “synaptic plasmatic membranes” (SPMs), desprovidas de organelos no terminal nervoso e PSDs do estriado e córtex a partir do murganho transgénico YAC128 (expressam mHTT humana completa) versus murganhos WT numa fase inicial (3 meses de idade) e tardia (9-12 meses de idade), e caudato cerebral humano postmortem proveniente de doentes com DH e indivíduos controlo. Nos BL, os resultados indicam níveis inalterados de sinaptofisina no estriado de 3 meses e córtex de 3 meses e 9-12 meses de YAC128 versus WT; dados preliminares no estriado 9-12 meses YAC128 vs WT sugerem uma diminuição nos níveis de proteína sinaptofisina. Nos SPMs, os resultados mostraram uma tendência para um aumento nos níveis de proteína da neuroligina-3 em 3 meses de SPMs estriatais, no entanto, nenhuma alteração foi detectada em SPMs corticais 3mo e 9-12mo. Os níveis de actina permaneceram inalterados em ambas as regiões do cérebro em 3 meses e 9-12 mo SPMs. Os dados mostram uma diminuição significativa nos níveis de SAPAP3 em PSDs isoladas de caudado de doentes com DH e no estriado de murganhos YAC128 com 3 meses, mas não no córtex. No entanto, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA de SAPAP3 no estriado ou no córtex de murganhos YAC128 versus WT. As proteínas PSD-95 e Homer também se apresentavam diminuídas nas PSDs de doentes de Huntington. Não foram observadas alterações nas subunidades do recetor N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR), nomeadamente GluN1, GluN2A ou GluN2B, em PSDs do estriado de murganho YAC128; no entanto, foi detetada uma diminuição de GluN1, e uma tendência para uma diminuição de GluN2A e GluN2B nas PSDs corticais de murganhos YAC128 com 9-12 meses de idade. A caracterização adicional das PSDs do murganho YAC128 mostrou uma diminuição nos níveis de actina e um aumento nos níveis de Homer aos 3 meses idade; em contraste, as PSDs corticais mostraram uma diminuição de Sorbs2 em murganhos YAC128 de 3 meses e uma tendência para uma diminuição da Homer em murganhos transgénicos com 9-12 meses de idade. As PSDs do caudado humano DH exibiram uma diminuição nos níveis de Homer, mas os níveis de actina permaneceram inalterados. Além disso, mostrámos a presença da proteína VDAC1 mitocondrial em ambas as PSDs do cérebro de murganhos YAC128 (estriado e córtex) e no caudado humano DH; observaram-se níveis reduzidos de VDAC1 no caudado de doentes de Huntington e uma tendência para um decréscimo em PSDs do murganho YAC128 com 9-12 meses. Uma possível interação direta entre HTT ou mHTT com proteínas PSD também foi abordada neste estudo. Dados preliminares indicam que não há interação entre as proteínas HTT (WT ou mutante) e SAPAP3, Homer ou Shank3. Em conclusão, este estudo mostra uma diminuição precoce de SAPAP3 e actina, mas um aumento de Homer em PSDs do estriado de murganhos YAC128, sugerindo que estas proteínas poderão constituir em marcadores precoces da DH. Por outro lado, as subunidades NMDAR (no córtex) e VDAC1 (estriado e córtex) parecem sofrer alteração em fases sintomáticas tardias da doença. Embora mais estudos sejam necessários para estabelecer a influência precisa da mHTT nas sinapses glutamatérgicas cortico-estriatais, este estudo poderá contribuir para uma visão geral das alterações proteicas da PSD na DH e a sua possível relevância nas alterações comportamentais associadas com a DH.