Effects of incretin-based therapies on the gastrointestinal motility of an animal model of Multiple Sclerosis

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) characterized by myelin sheath degradation (demyelination), gliosis and consequent neuroaxonal degeneration and disruption of neuronal signaling. In addition to central degeneration, MS also involves dysregulation of the enteric nervous system (ENS), which leads to gastrointestinal (GI) complications, namely constipation. Since therapies currently used in MS are only effective on reducing the frequency of relapses and the most progressive forms of the disease are still practically untreatable, there is the need to find new neuroprotective and anti-inflammatory therapies that can be useful in progressive stages of MS. Incretin-based therapies, namely dipeptidyl-peptidase IV (DPP-IV) inhibitors, seem to be a good alternative not only due to its proliferative, neuroprotective and anti-inflammatory properties, mainly because of consequent increased levels of Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and neuropeptide Y (NPY), but also to their metabolic effects at a peripheral level that can counteract some of the GI symptoms associated to the disease. However, both GI dysfunction and DPP-IV/GLP-1/NPY pathways remain practically uncharacterized in some animal models of induced-MS, such as cuprizone (CPZ)-induced demyelination mouse model.Taking all these into account, the main aim of this study was to evaluate the effects of Sitagliptin, a DPP-IV inhibitor, in the intestinal motility of the CPZ animal model, using the ileum as the target region. For this, 10-week old C57BL/6 mice were fed with an oral solution of CPZ (0.2%) for five weeks (CPZW5), followed by CPZ withdraw, in half of them, during two more weeks (CPZW7). Two control animal groups were also analyzed in the same time points (CTRLW5 and CTRLW7). Another two animal groups of seven-week CPZ experiment were also analyzed, being administered, through a jelly vehicle, with two weeks of treatment with Sitagliptin (CPZ+Sita(T)) or seven weeks of a preventive treatment of Sitaglitpin (CPZ+Sita(P)). The demographic and biochemical profile of all animal groups, where parameters like body weight, glycemia and thymus weight were analyzed, allowed to successful characterize and confirm the animal model of induced-MS. Additionally, MBP (myelin basic protein) ileal levels allowed to confirm that CPZ intoxication also induced demyelination in the ENS. The efficacy of Sitagliptin administration were confirmed through the DPP-IV activity assay in serum samples, since this activity was reduced by approximately 80% on both animal groups treated with Sitagliptin. Functional studies performed on isolated ileum from all animal groups confirmed that CPZ intoxication alters the intestinal contractile response to electrical field stimulation in an inhibitory way, which turns this a good animal model to study GI dysfunctions associated with MS, specially constipation. Moreover, the Sitagliptin treatment reverted the inhibitory effects of CPZ intoxication, since interfered with the intestinal motility in an excitatory way. The preventive treatment, in its turn, normalized the contractile response, tending to reach control group motility. This normalization appears to involve the inhibitory effects of GLP-1, not only because the blockade of GLP-1 receptor (GLP-1R) with Exendin-3 lead to an increase on intestinal motility only on groups submitted to Sitagliptin administration, but also because GLP-1R density was significantly higher in the preventive group. Finally, functional studies performed in the presence of Y1 receptor (Y1R) antagonist, BVD-10, allowed to conclude that this receptor only contributed in an inhibitory way to intestinal motility in a disease state, due to a possible alteration on Y1R expression or NPY levels. With this study, we can conclude that CPZ animal model reflects the most frequent GI dysfunction present in MS patients and the Sitagliptin appears to be a good therapeutical option, not only because of their neuroprotective and anti-inflammatory effects, but also due to their contribution to ameliorate the GI dysregulation, improving the lifestyle of MS patients.

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória crónica imuno-mediada do sistema nervoso central (SNC) caracterizada pela degradação da bainha de mielina (desmielinização), gliose, consequente degeneração axonal e interrupção da neurotransmissão. Para além da degeneração a nível central, a EM também envolve desregulação do sistema nervoso entérico (SNE), que leva a complicações gastrointestinais (GI), essencialmente obstipação. Uma vez que as terapêuticas atualmente utilizadas para o tratamento da EM são apenas eficazes na redução da frequência dos surtos, as formas progressivas da doença continuam sendo praticamente incuráveis, existindo a necessidade de encontrar novas terapêuticas que sejam neuroprotetoras e anti-inflamatórias e que ao mesmo possam ser utilizadas nas formas progressivas da doença. As terapêuticas baseadas em incretinas, nomeadamente os inibidores da dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV), aparentam ser uma boa alternativa, não só devido às suas propriedades proliferativas, neuroprotetoras e anti-inflamatórias, essencialmente pelo aumento dos níveis do peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) e do neuropeptídeo Y (NPY), mas também por causa dos seus efeitos a nível periférico que compensam alguns sintomas GI associados à EM. No entanto, tanto a disfunção GI como a via DPP-IV/GLP-1/NPY permanecem por caracterizar em alguns modelos animais de EM induzida, nomeadamente o modelo animal de desmielinização induzida por administração de cuprizona (CPZ).Tendo em conta tudo isto, o principal objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da Sitagliptina, um inibidor da DPP-IV, na motilidade intestinal do modelo animal de CPZ, usando o íleo como região alvo. Para isto, murganhos da estirpe C57BL/6 com 10 semanas de idade foram alimentados oralmente com uma solução de CPZ (0,2%) durante cinco semanas (CPZW5), seguido da sua suspensão por mais duas semanas (CPZW7). Dois grupos de animais foram usados como controlo, sendo analisados nos mesmos dois espaços temporais (CTRLW5 e CTRLW7). Além disso, mais dois grupos de animais submetidos a sete semanas de experiência foram também utilizados, sendo administrados de Sitagliptina oralmente, através de um veículo gelatinoso, durante as últimas duas semanas (CPZ+Sita(T)) ou preventivamente durante as sete semanas de experiência (CPZ+Sita(P)). O perfil demográfico e bioquímico de todos os grupos de animais, onde parâmetros tais como o peso corporal, a glicemia e o peso do timo foram avaliados, permitiram caracterizar e confirmar o modelo animal de EM induzida. Além disso, os níveis de MBP (proteína básica de mielina) no íleo permitiram confirmar que a intoxicação com CPZ também induziu desmielinização no SNE. A eficácia da administração da Sitagliptina foi confirmada através do ensaio de atividade da DPP-IV realizado em amostras de soro, no qual esta atividade se encontrava reduzida aproximadamente 80% em ambos os grupos de animais tratados com Sitagliptina. Os estudos funcionais realizados em íleo isolado deste modelo animal comprovaram o comprometimento da resposta contráctil à estimulação elétrica de campo no pico de desmielinização, o que torna este um bom modelo animal para estudar disfunções GI associadas à EM, essencialmente obstipação. O tratamento com Sitagliptina reverteu este efeito sobretudo quando utilizada como tratamento preventivo, com o qual se igualou a situação controlo. Para esta normalização parece ser determinante o GLP-1 uma vez que os níveis proteicos de GLP-IR analisados por Western Blotting estavam significativamente aumentados no grupo sujeito ao tratamento preventivo. Estes resultados do estudo molecular foram reforçados pelos estudos funcionais na presença do antagonista seletivo do GLP-IR Exendin-3 que confirmaram o efeito inibitório mediado pelo GLP-1R. No entanto, este recetor não parece contribuir para a resposta contrátil basal à estimulação do campo elétrico nos grupos controlo e animais CPZ não submetidos à Sitagliptina. Por outro lado, estudos funcionais realizados na presença do antagonista seletivo do recetor Y1 (Y1R), o BVD-10, permitiu concluir que este recetor apenas contribui de forma significativa para a motilidade intestinal na presença da patologia, devido a uma possível alteração da expressão do Y1R ou dos níveis de NPY, que necessita de futura investigação. Com este estudo, foi possível concluir que o modelo animal de CPZ reflete a disfunção GI mais frequente em doentes com EM e que a Sitagliptina aparenta ser uma boa opção terapêutica, não só pelos seus efeitos neuroprotetores e anti-inflamatórios, mas também pelos seus efeitos na desregulação GI, melhorando assim a qualidade de vida relacionada com a saúde destes doentes.