Métodos de esterilização versus adesão celular para scaffolds numa aplicação em Medicina Dentária

Abstract

In the last decades there has been a extraordinary evolution in the area of Dentistry, especially in Implantology. Given the aesthetic and functional requirements of an increasingly demanding society, there is often the need to resort to reconstructive surgeries, which allow the regeneration of bone tissue once lost. Biomaterials, both from human, animal or synthetic origin, have been used as bone replacement for implants. They intend to mimetize the bone physiology, act as a support and potentiate the formation of new tissue, without inducing immune response.The present thesis is included in a wider project intending to fill in bone defects for Dentistry. The main objective has been to evaluate the cytotoxicity of different scaffold formualtions, sterilized with different common techniques. These scaffolds were produced by an additive manufacturing technique, consisting of poly(caprolactone) (PCL) or PCL and hidroxyapatite (HA). They were manufactured not only with different levels of HA (10% or 25%), but also from two different origins: natural and synthetic. Regarding their structural composition, scaffolds are formed by filaments which thickness varies between 300 and 600 m, and with an angle variation between filaments of 0º/90º and 0º/45º. The goal of such scaffolds, with distinct formulations and architectures, steilized by the three most used methods of sterilization in clinics, namely ethlyene oxide, gamma radiation and plasma, was to infer which combination would have the greatest influence on biological performance, correlated with the sterilization process.The different scaffolds were sterilized and evaluated through microbiological assays, to confirm the effectiveness of the sterilization method. The results of these tests confirmed the absence of microbial growth, showing that the results are in compliance with the current rules.When tested in vitro, as support for fibroblast, macrocytic, and their co-culture, an uniform cell distribution throughout the scaffold was observed, indicating an affinity for these structures.In order to comprove the integration process in vivo some of the scaffolds, those obtaining the best and the worst results in vitro, were selected. After 1 month post implantation, the integration process was evaluated, by macro and microscopic observation. Regarding the cicatrization process and inflammatory reaction the results indicate that they proceeded as expected, obtaining a good healing. This suggests a good integration verified by the histological technique.Attempting to obtain stem cells for further differentiation into bone-like producing cells, from young dental pulp and aplical papilla, explant culture assays were performed. However, it was not possible to obtain these results in order to proceed further with cell differentiation. The results of the in vitro tests allowed to refine the selection of the best formulations, promoting the regeneration of bone defects in the oral cavity. It has been shown that sterilization methods are directly correlated with the formulation and duration of the study.

Nas últimas décadas tem-se assistido a uma crescente evolução na área da Medicina Dentária, sobretudo ao nível da Implantologia. Dados os requisitos estéticos e funcionais de uma sociedade cada vez mais exigente, muitas vezes há a necessidade de recorrer a cirurgias reconstrutivas, que permitam regenerar o tecido ósseo outrora perdido. Nestas cirurgias, por sua vez, utilizam-se biomateriais de substituição óssea de origem humana, animal ou sintética que, implantados no organismo, mimetizam a fisiologia óssea, atuam como suporte e potenciam a formação do novo tecido, sem que seja induzida resposta imunológica.Neste contexto surgiu o tema desta dissertação que teve como principal objetivo avaliar a citotoxicidade de diferentes scaffolds quando sujeitos a três técnicas de esterilização distintas, para uma futura aplicação em Medicina Dentária para preenchimento de defeitos ósseos. Os referidos scaffolds foram produzidos por uma técnica de fabricação aditiva, sendo constituídos por poli(caprolactona) (PCL) ou PCL e hidroxiapatite (HA). Para o efeito, foram fabricados não só com diferentes teores de HA, 10% ou 25%, mas também tendo duas origens distintas: natural e sintética. Quanto à sua composição estrutural, os scaffolds são formados por filamentos cuja espessura varia entre 300 e 600 m e cujo ângulo entre os filamentos varia entre 0º/90º e 0º/45º. O objetivo ao desenvolver scaffolds com formulações e arquiteturas distintas, sujeitos a três métodos de esterilização frequentemente usados na clínica, a saber, a esterilização por óxido etileno, radiação e esterilização por plasma, era a possibilidade de inferir sobre qual das combinações teria maior influência no desempenho biológico, correlacionado com o processo de esterilização.Os diferentes scaffolds foram esterilizados e, posteriormente, avaliados através de ensaios microbiológicos, para confirmar a eficácia do método de esterilização. Os resultados destes ensaios confirmaram a ausência de crescimento microbiano, revelando que os resultados estão em conformidade com as normas em vigor. Quando testados in vitro, como suporte para a cultura de células fibroblásticas, macrocíticas e sua co-cultura, observou-se uma distribuição uniforme das células por todo o scaffold, indicando afinidade com estas estruturas.De forma a provar o processo de integração in vivo, foram selecionados alguns dos scaffolds que obtiveram os melhores e piores resultados in vitro. Após 1 mês da implantação, o processo de integração foi avaliado, por observação macro e microscópica, em relação ao processo de cicatrização e reação inflamatória. Da observação macroscópica, os resultados indicam que o processo de reação inflamatória decorreu de acordo com o esperado, obtendo-se uma boa cicatrização sugestiva de uma boa integração, verificada pela técnica histológica. Na tentativa de obter células estaminais para posterior diferenciação em células produtoras de osso, a partir de polpa dentária e papila apical jovens, realizaram-se ensaios de cultura de explantes. No entanto, não foi possível obter estes resultados para proceder com a diferenciação celular. Os resultados dos testes in vitro permitiram refinar a seleção de melhores formulações promotoras da regeneração de defeitos ósseos da cavidade oral, sendo que os métodos de esterilização demonstraram estar diretamente correlacionados com a formulação e a duração de ensaio.