Two is better than one: A combined therapy to prevent in-stent restenosis

Abstract

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte, em todo o mundo, sendo a doença arterial coronária a mais comum, causada pela diminuição do fluxo sanguíneo na sequência de uma oclusão, total ou parcial, das artérias coronárias. O tratamento da doença arterial coronária é geralmente realizado por meio de uma intervenção coronária percutânea, na qual, através de uma angioplastia de balão, um stent é implantado dentro da artéria coronária para evitar a sua estenose. No entanto, a insuflação do balão exerce elevadas pressões contra a parede, resultando na desnudação do endotélio e na hiperplasia da neoíntima, caracterizada pela proliferação de células do músculo liso na tunica intima. Os stents eluídos com sirolimus, um análogo da rapamicina e um potente agente citostático, provaram ser eficazes a prevenir a migração e proliferação de células do músculo liso. No entanto, o sirolimus leva à disfunção endotelial e suprime a capacidade de reendotelização da coronária, o que pode causar a reestenose em stent. A sinvastatina é uma estatina rotineiramente utilizada na prática clínica devido às suas propriedades em inibir a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase, bloqueando assim a síntese do colesterol. Uma vez que a sinvastatina demonstrou ser capaz a inibir a proliferação de células do músculo liso e tem sido descrita possuir efeitos protetores na migração e proliferação de células endoteliais, neste estudo propomos que o efeito deletério do sirolimus no contexto da reestenose em stent pode ser revertido pela terapia combinada da rapamicina e sinvastatina.Neste trabalho, avaliou-se o efeito da rapamicina e/ ou sinvastatina na migração, proliferação, potencial angiogénico e atividade autofágica de dois tipos de células endoteliais, nomeadamente, MCEC-1, uma linha celular de células endoteliais cardíacas de murino e PAEC, células endoteliais primárias de artérias pulmonares de humano.Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a inibição da migração em MCEC-1 induzida pela sinvastatina pode ser parcialmente revertida pela rapamicina, enquanto que em PAEC, a rapamicina não demonstrou melhorar o efeito inibitório da sinvastatina na migração. No entanto, observámos uma tendência para doses mais altas de sinvastatina aumentar a migração. Em relação à proliferação, as taxas de proliferação de MCEC-1 não foram alteradas nem pela rapamicina nem pela sinvastatina ao passo que, em PAEC, a incubação com sinvastatina, na presença ou ausência de rapamicina, reduziu a capacidade de proliferação destas células. Uma vez mais, PAEC demonstraram uma propensão para responderem melhor sob doses mais elevadas de sinvastatina.Através da ensaios de tubulação in vitro, o nosso estudo mostrou que o tratamento de MCEC-1 com rapamicina induz uma redução na capacidade angiogénica destas células, que podia ser revertida pela sinvastatina. Por outro lado, em PAEC, nem a sinvastatina nem a rapamicina afectaram a formação de estruturas capilares semelhantes a novos vasos, sugerindo que estes compostos não interferem com a capacidade angiogénica destas células. No entanto, uma dose maior de sinvastatina não foi testada. Além disto, também avaliámos o efeito destes compostos na modulação da resposta autofágica das células endoteliais e do músculo liso. Com base nos resultados que mostram a acumulação de p62 e LC3-II na presença de um inibidor do lisossoma, demonstramos que tanto as células endoteliais como as do músculo liso apresentam uma elevada atividade autofágica basal. Além disso, a Conexina 43, um substrato de autofagia, também é acumulada. Este estudo permitiu ainda demonstrar que abordagens “clássicas” para modular a autofagia, como é o caso da privação de soro ou de aminoácidos, ou o tratamento com rapamicina, levam também a uma ativação da autofagia nas MCEC-1.No que diz respeito ao efeito da sinvastatina na modulação da autofagia nas células endoteliais estudadas, demonstramos que este efeito é diferente em MCEC-1 e PAEC. De facto, os nossos resultados sugerem que a maquinaria de autofagia envolvida varia de acordo com o tempo de indução de autofagia, sendo numa primeira fase dependente de AMPK, enquanto que para períodos mais longos a Beclina-1 parece ter um papel preponderante. Com base nos resultados a mostrar que o efeito, em termos de níveis de LC3-II, da sinvastatina na presença de bafilomicina é semelhante ao efeito da bafilomicina isolada, sugerimos que a sinvastatina inibe a fusão do autofagossoma com o lisossoma.Em células do músculo liso, a sinvastatina não induziu um efeito na atividade autofágica nas primeiras 24 horas, enquanto que para incubações de 48 horas se verificou uma diminuição dos níveis de LC3-II, sugerindo que uma estimulação da autofagia. Este estudo demonstra que o efeito da rapamicina e da sinvastatina na migração, proliferação e capacidade angiogénica varia consoante o tipo de célula endotelial e que estes compostos exercem impactos diferentes na autofagia das células estudadas.

Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide, being coronary artery disease (CAD) the most common one, caused by a shortage of blood supply to the heart due to partial or total occlusion of coronary arteries. The treatment of CAD usually involves percutaneous coronary intervention (PCI), in which, through a balloon angioplasty, a stent is implanted within the coronary artery to prevent its stenosis. The balloon insufflation, however, exerts high pressures against the wall resulting in endothelial denudation and consequent neointima hyperplasia, characterised by the proliferation of smooth muscle cells (SMC) within tunica intima. Stents eluted with sirolimus (SES), an analogue of rapamycin and a potent cytostatic agent, have proven efficient arresting SMC migration and proliferation. Nevertheless, sirolimus leads to endothelial dysfunction and supresses re-endotheliazation capacity of the coronary, which may cause in-stent restenosis (ISR). Simvastatin is a statin routinely used in clinical practice due to its properties to inhibit 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase, thus blocking cholesterol synthesis. Since simvastatin has proven able to inhibit SMC proliferation and has been described to hold protective effects in migration and proliferation of endothelial cells (EC), in this study we propose that the deleterious effect of sirolimus in the context of ISR may be reverted by the combined therapy of rapamycin and simvastatin. In this work, we assessed the effect of rapamycin and/ or simvastatin in migration, proliferation, angiogenic potential and autophagy activity of two types of EC, namely, MCEC-1, a mouse cardiac endothelial cell line, and PAEC, human pulmonary arterial endothelial cells.The results obtained demonstrated that MCEC-1 cell migration inhibition caused by simvastatin can be partially reverted by rapamycin, whereas in PAEC, the incubation with rapamycin did not ameliorate the inhibitory effect of simvastatin in migration. However, we observed a tendency for higher doses of simvastatin to increase migration.Regarding proliferation, MCEC-1 proliferation rates were not altered neither by rapamycin or simvastatin, whereas in PAEC, the incubation with simvastatin, in the presence or absence of rapamycin, impaired proliferation capacity of these cells. Once more, PAEC demonstrated a propensity to response better under higher doses of simvastatin.Using tube formation in vitro assays, our work showed that MCEC-1 treatment with rapamycin induced a decrease in the angiogenic capacity of these cells, which could be reverted by simvastatin. On the other hand, in PAEC, neither simvastatin nor rapamycin affected the formation of capillary-like structures, suggesting that the angiogenic properties of these cells are not being affected by these compounds. However, a higher dose of simvastatin was not tested.Furthermore, we evaluated the effect of these compounds in autophagic response of EC and SMC. Based on the results showing the accumulation of p62 and LC3-II in the presence of a lysosome inhibitor, we demonstrated that both EC and SMC present a high basal autophagic activity. In accordance, Connexin 43 (Cx43), an autophagy substrate, also accumulated. This study also established that approaches already known to be autophagy modulators, such as serum or amino acid deprivation, or treatment with rapamycin, also lead to an autophagy activation in MCEC-1. Moreover, our study showed that the effect of simvastatin in autophagy is different in MCEC-1 and PAEC, suggesting this is a cell-specific response. Additionally, we demonstrated that the autophagy machinery involved varies according to the duration of autophagy induction, in a first stage being AMPK-dependent, while in longer periods Beclin-1 seems to have a preponderant role. Based in the results demonstrating that the effect, regarding LC3-II levels, of simvastatin in the presence of bafilomycin is similar to the effect of bafilomycin alone, we suggest that simvastatin inhibits the fusion of the autophagosome with the lysosome. Regarding SMC, simvastatin did not affect autophagy activity in the first 24 hours of incubation, whereas in 48 hours of incubation it was observed a decrease of LC3-II levels, suggesting an autophagy stimulation. This study demonstrates that the effect of rapamycin and simvastatin in cell proliferation, migration and angiogenesis capacity, is endothelial cell-type specific and that these compounds exert different impacts in the studied cells.