Validação de um kit de amplificação por PCR: PowerPlex® Fusion 6C System, Promega

Abstract

The analysis of genetic profiles can be done by studying the nuclear DNA through its variety of polymorphic markers, more specifically with Short Tandem Repeats (STRs). The STRs are short sequences that vary in length from 2 to 7 base pairs that repeat alongside the genome, allowing individual differentiation. Through the PCR amplification method, it is possible to generate several copies of specific STRs for posterior analysis of the genetic profiles.To speed up and make the proceedings of DNA amplification easier, most forensic laboratories resort to PCR amplification kits, however, to use these kits in the laboratory its necessary to evaluate and validate them in a way to determine its own efficiency and applicability in the forensic casuistic. This work aimed at describing the proceedings and parameters used to validate internally the PCR amplification kit, PowerPlex® Fusion 6C by Promega, for posterior implementation in the laboratorial routine of the Forensic Genetic and Biology Service - Central branch (SGBF-C) of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences (INMLCF) in Coimbra, Portugal. The PowerPlex® Fusion 6C System allows multiplex PCR reactions, through simultaneous amplification and posterior detection by fluorescence of 27 loci. To proceed with the internal validation of the PowerPlex® Fusion 6C System kit several validation parameters were studied with samples of blood and saliva collected, voluntarily, to the employees of SGBF-C. DNA from the samples was extracted through the extraction methodologies of Chelex® 100, Prep-n-Go™ and PrepFiler™, some samples were quantified with the Quantifiler Trio DNA Quantification kit and all the samples were amplified with the PowerPlex® Fusion 6C System kit. The specificity and precision of the method were verified and analysis studies were also developed for mixtures and contamination of samples. Lastly, some changes to the amplification original protocol of the kit were made to optimize its use in the laboratorial routine of SGBF-C. This study permitted the characterization of the principal limitations and advantages of the PowerPlex® Fusion 6C System when used in the Laboratory and demonstrate internally that its purpose is fit to use in SGBF-C. All the changes that were done were based in the original protocol and did not made it impossible to obtain results, contributing to demonstrate the robustness and versatility of the kit and consequently permitting its optimization and internal validation.

A análise de perfis genéticos pode ser efetuada através do estudo de ADN nuclear com recurso a vários marcadores polimórficos, nomeadamente Short Tandem Repeats (STRs). Os STRs correspondem a curtas sequências de 2 a 7 pares de bases que se repetem ao longo do genoma, permitindo, assim a discriminação entre indivíduos. Através da amplificação de ADN por PCR é possível gerar várias cópias de STRs específicos, para posterior análise dos perfis genéticos. Para facilitar e rentabilizar os processos de amplificação de ADN, muitos laboratórios forenses recorrem a kits de amplificação por PCR. No entanto, para a aplicação de um kit no laboratório é necessário que o mesmo seja avaliado e validado de forma a determinar a sua eficácia e aplicabilidade na casuística forense. Com este trabalho, pretendeu-se descrever os procedimentos e parâmetros utilizados para validar internamente o kit de amplificação por PCR PowerPlex® Fusion 6C, Promega, para posterior implementação na rotina laboratorial do Serviço de Genética e Biologia Forenses da delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF).O kit de amplificação por PCR PowerPlex® Fusion 6C System, permite reações de PCR em multiplex, através da amplificação simultânea e posterior deteção por fluorescência, de 27 loci. Para proceder à validação interna do kit PowerPlex® Fusion 6C System foram estudados diversos parâmetros de validação com recurso a amostras de sangue e saliva, colhidas, voluntariamente, a colaboradores do SGBF-C. O ADN das amostras foi extraído através das metodologias de extração de Chelex® 100, Prep-n-Go™ e PrepFiler™, algumas foram quantificadas com o kit Quantifiler® Trio DNA Quantification e todas foram amplificadas com o kit PowerPlex® Fusion 6C System. Verificou-se a especificidade e a precisão do método e foram realizados estudos de análise de misturas e contaminação de amostras. Por fim, procedeu-se a alterações ao protocolo original de amplificação do kit, no sentido de otimizar a utilização do mesmo na rotina laboratorial do SGBF-C. Este estudo permitiu caracterizar as principais limitações e vantagens do kit PowerPlex® Fusion 6C System para utilização no Laboratório e demonstrar internamente que o mesmo se encontra apto para ser utilizado no SGBF-C. As alterações, efetuadas de acordo com as especificidades do Laboratório, não inviabilizaram os resultados obtidos, contribuindo assim para demonstrar a robustez e a versatilidade do kit e, consequentemente, permitir a sua otimização e validação interna.