Effect of methylphenidate on blood-brain barrier function in health and attention deficit hyperactivity disorder

Abstract

Methylphenidate (MPH) is an amphetamine-like psychostimulant that has become the primary drug of choice for treating attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD), a highly prevalent neuropsychiatric disorder with an onset in early childhood. ADHD includes behavioral and cognitive symptoms, such as inattention and/or impulsivity/hyperactivity. In more than 50% of children with ADHD, the symptoms persist into adolescence and adulthood. Moreover, the diagnosis of ADHD itself is non-consensual and several reports claim that physicians tend to be preoccupied with reducing symptoms via medication but often fail to recognize the context in which the behavior exhibits, which suggest that ADHD is being overdiagnosed in children. Despite being beneficial under ADHD conditions, MPH misuse is nowadays a problem with high impact on society. The full comprehension of the cellular/molecular mechanisms trigger by MPH use is still elusive. To date, most of the studies that explain the underlying MPH effects on central nervous system have focused on intra-neuronal events, particularly on dopaminergic alterations. The impact of MPH on blood brain-barrier (BBB) function has never been addressed before neither in non-pathological conditions nor in ADHD. The BBB is a barrier highly selective responsible for the regulation and maintenance of brain homeostasis creating a proper microenvironment for neural function. Given the evidence of BBB damage as an early event in many neurological conditions, it is not surprising that there is a growing interest in the BBB as a therapeutic target. Thus, the major goal of the present thesis was to clarify the effects of MPH on the BBB function in both physiological and ADHD conditions. Specifically, we aimed to investigate the direct impact of MPH on human brain microvascular endothelial cells (HBMVECs), and to evaluate the effect of chronic MPH use during normal and ADHD rat neurodevelopmental on the neurogliovascular unit, brain immune surveillance neuroinflammation, and behavior. This thesis is organized in 5 chapters. In chapter 1 is presented a review of the literature about the topics explored in this work with emphasis in ADHD, MPH and BBB. In chapter 2, we evaluated the direct effect of MPH on HBMVEC. It was found that MPH increases brain endothelial cell permeability by promoting the vesicular transport. Specifically, we identified the molecular event critical to MPH-induced transcytosis, showing that c-Src is activated in result of intracellular reactive oxygen species generated by Rac1/NOX that interacts and phosphorylates Caveolin1, resulting in caveolae formation and consequent vesicular permeability. Next in chapter 3, we unraveled MPH chronic outcome in the healthy brain as well as cognitive concerns that might arise from its misuse. Since hippocampus is highly involved in memory/learning processes we focused on this brain region. Our data revealed that higher doses of MPH cause endothelial dysfunction and activation with a consequent increase of leukocyte infiltration by transcytosis. In addition to disruption of hippocampal vasculature, alterations in astrocytic morphology and synaptic machinery were also observed. These neurogliovascular disturbances culminated in memory deficit. Contrariwise, a lower dose of MPH improved cognition in parallel with an increase of astrocytic processes but with no major effect on BBB permeability. Furthermore, we showed that MPH misuse modulated AKT/CREB signaling pathway, which can explain alterations on cognitive performance. Afterwards, in chapter 4, we dissected the impact of early-life chronic consumption of MPH on brain immune surveillance and neuroinflammation in both physiological and ADHD conditions. This work was focused on the prefrontal cortex that is a brain region with a prominent role in the pathophysiology of ADHD. Our results show that chronic exposure to a higher dose of MPH caused BBB leakage and elicited an anxious-like behavior in both healthy and ADHD conditions. Nevertheless, BBB dysfunction was more prominent in control animals, which was proved by a downregulation and disruption of intercellular junctions, an increase of microvessels vesicles, and endothelium activation concomitant with infiltration of peripheral immune cells. Moreover, independently of the dose used, MPH triggered a robust oxidative and neuroinflammatory response in healthy rats shown by astrocytes and microglial cells activation and upregulation of pro-inflammatory cytokines. On the contrary, in ADHD animal model, MPH at the lower dose restored brain homeostasis by decreasing the inflammatory and oxidative status. Moreover, the MPH immune-modulatory effects in both animal conditions seem to be mediated through NF-κB/NLRP3 signaling pathways. Finally, in chapter 5, a general discussion with final remarks is presented. Overall, this thesis provides evidence that MPH acts directly on endothelial cells impairing BBB integrity, which may favor the access of peripheral cells into the brain. Additionally, MPH has an effect on glial cells leading to a neuroinflammatory response and oxidative status. Behavior alterations were also observed, including spatial working memory deficit and anxiety-like behavior. Herein, we improved our understanding about neurogliovascular unit alterations associated with chronic MPH treatment during development, and how these changes depend on the dose of MPH and (non)-pathological conditions, which highlights the importance of an appropriate MPH dose regimen for ADHD and an adequate diagnosis to avoid MPH misuse.

O metilfenidato (MFD) é um psicoestimulante do grupo das anfetaminas usado como primeira linha de tratamento da perturbação de hiperatividade e défice de atenção (PHDA). PHDA é uma perturbação neuropsiquiátrica altamente prevalente com inicio na infância e que inclui sintomas comportamentais e cognitivos, nomeadamente falta de atenção e/ou impulsividade/hiperatividade. Normalmente, em mais de 50% das crianças com PHDA os sintomas persistem até à adolescência e fase adulta. Além disso, o diagnóstico desta patologia não é consensual com vários relatórios a afirmar que os médicos tendem a estar mais preocupados com a redução dos sintomas através da medicação e muitas vezes não conseguem reconhecer o contexto em que o comportamento é exibido, o que sugere que a PHDA está a ser sobrediagnosticada em crianças. Apesar de ser benéfico em condições de PHDA, o uso indevido de MFD é hoje em dia um problema com alto impacto na sociedade. Os mecanismos celulares/moleculares desencadeados pelo uso de MFD ainda são largamente desconhecidos. Até à data, a maioria dos estudos que explicam os efeitos no sistema nervoso central subjacentes ao uso do MFD têm-se focado nos eventos intraneuronais, particularmente nas alterações dopaminérgicas. Neste sentido, o impacto do MFD na função de barreira hematoencefálica (BHE) nunca foi abordado antes, quer em condições não patológicas quer em situações de PHDA. A BHE é uma barreira altamente seletiva responsável pela regulação e manutenção da homeostasia cerebral, criando um microambiente adequado para a função neuronal. Visto que a disfunção na BHE é considerada um evento precoce em muitas patologias do cérebro, não é surpreendente que haja um interesse crescente na BHE como um alvo terapêutico. Desta forma, o principal objetivo da presente tese foi esclarecer os efeitos do MFD na função da BHE em condições fisiológicas e de PHDA. Especificamente, pretendeu-se investigar o efeito direto do MFD nas células endoteliais da microvasculatura do cérebro humano (CEs) e avaliar o efeito do uso crónico de MFD durante o desenvolvimento neurológico normal e numa condição de PDHA, tendo como principais focos a unidade neurogliovascular, a resposta imunitária e neuroinflamatória, bem como as alterações comportamentais. Esta tese encontra-se organizada em 5 capítulos. No capítulo 1, é apresentada uma revisão da literatura onde se exploram tópicos essenciais à compreensão deste trabalho dando ênfase à PHDA, MFD e BHE. No capítulo 2, avaliamos o efeito direto do MFD nas CEs. Verificou-se que o MFD aumenta a permeabilidade das CEs promovendo o transporte vesicular. Especificamente, identificámos a via de sinalização intracelular responsável pela transcitose induzida por MFD, mostrando que a c-Src é ativada por espécies reativas de oxigénio intracelular gerados pelo complexo Rac1/NOX que por sua vez interage e fosforila a caveolina 1, resultando na formação de cavéolas e consequente permeabilidade vesicular. Em seguida, no capítulo 3, desvendámos os efeitos resultantes do consumo crónico do MFD no cérebro saudável, bem como as consequências cognitivas que podem surgir do seu uso indevido. Tendo em consideração que o hipocampo está amplamente envolvido em processos de memória/aprendizagem, focámos o nosso estudo nesta região cerebral. Concluímos que doses mais altas de MFD causam disfunção e ativação endotelial com o consequente aumento da infiltração de leucócitos por transcitose. Além da disfunção da vasculatura do hipocampo, também foram observadas alterações na morfologia dos astrocítos e na maquinaria sináptica. Estas alterações neurogliovasculares culminaram em défice de memória. Por outro lado, uma menor dose de MFD melhorou a memória em simultâneo com um aumento dos prolongamentos astrocíticos, mas sem efeito significativo na permeabilidade da BHE. Adicionalmente, mostrámos que o uso indevido do MFD é capaz de modular a via de sinalização da AKT/CREB, o que pode explicar as alterações no desempenho cognitivo. Posteriormente, no capítulo 4, avaliámos o impacto do consumo crónico de MFD no período correspondente desde a infância até à adolescência tardia na vigilância imunológica do cérebro e na neuroinflamação em condições fisiológicas e de PHDA. Este trabalho foi focado no córtex pré-frontal, região cerebral com um papel proeminente na fisiopatologia da PHDA. Os nossos resultados mostram que a exposição crónica a uma dose mais elevada de MFD causou um aumento da permeabilidade da BHE e incitou um comportamento do tipo ansioso em ambas as condições estudadas, saudável e PHDA. No entanto, a disfunção da BHE foi mais proeminente nos animais sem patologia, o que foi evidenciado por uma diminuição dos níveis e rutura das junções intercelulares, um aumento de vesículas nos microvasos e ativação do endotélio, concomitante com a infiltração de células do sistema imunitário periférico para o cérebro. Para além disso, independentemente da dose utilizada, o MFD desencadeou uma resposta oxidativa e neuroinflamatória robusta nos ratos saudáveis comprovado pela ativação dos astrócitos e das células da microglia, assim como pelo aumento de citocinas pró-inflamatórias. Pelo contrário, no modelo animal de PHDA, o MFD na dose mais baixa restaurou a homeostasia cerebral, diminuindo o estado inflamatório e oxidativo. Além disso, os efeitos imunomoduladores do MFD em ambos os modelos animais parecem ser mediados pela via de sinalização do NF-κB/NLRP3. Finalmente, no capítulo 5, uma discussão geral com considerações finais é apresentada. Em conclusão, esta tese dá-nos evidências de que o MFD atua diretamente nas CEs prejudicando a integridade da BHE, o que pode favorecer o acesso das células periféricas ao cérebro. De realçar que o MFD tem também um efeito nas células da glia, desencadeando uma resposta neuroinflamatória e causando stress oxidativo. Alterações comportamentais também foram observadas, incluindo défice de memória de trabalho e comportamento do tipo ansioso. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão das alterações que ocorrem na unidade neurogliovascular devido a um tratamento crónico com MFD durante o desenvolvimento numa condição fisiológica versus PHDA, e como essas alterações dependem ainda da dose de MFD. Estas observações evidenciam a importância da dose terapêutica de MFD que é prescrita e de um diagnóstico mais objetivo para evitar o uso indevido de MFD.