Determinação de canabinóides em amostras biológicas por cromatografia líquida de alta resolução com espectrometria de massa : aplicação em toxicologia forense

Abstract

A marijuana, o haxixe e outros produtos psicoactivos obtidos da Cannabis sativa, são as drogas ilícitas mais produzidas e traficadas em todo o mundo. Por outro lado, paralelamente a um aumento do seu consumo na comunidade em geral, tem-se assistido a um acréscimo de casos de condução sob a sua influência. Tem sido demonstrado que a intoxicação provocada por este tipo de compostos está principalmente relacionada com a concentração do seu principio activo, o Δ9-Tetrahidrocanabinol (Δ9-THC), sendo frequentemente administrados com outras substâncias, tais como o alcool, exacerbando os seus efeitos psicoactivos e aumentando a possibilidade de ocorrência de acidentes de viação. Ao longo dos últimos anos, a comunidade cientifica, em parceria com algumas empresas envolvidas na produção de meios de detecção destas drogas, tem desenvolvido testes rápidos para a detecção de Δ 9-THC-COOH na urina, o metabolito ai mais abundante, quer para aplicação a nível do controlo laboral, quer na avaliação de programas de desintoxicação ou no controlo rodoviário. Contudo, sendo a detecção daquele metabolito apenas indicativo de consumo, a determinação de Δ9-THC em saliva fornecera uma melhor indicação de consumo recente, podendo ate ser considerada como uma melhor alternativa ao sangue para documentar esse uso recente. Apesar disso, os toxicologistas forenses continuam a ser solicitados para determinar o Δ9-THC e os seus metabolitos (Δ9- THC-OH e Δ9-THC-COOH) em amostras de sangue ou urina, aquando da sua positividade nos testes de triagem, quer em saliva quer em urina, bem como para a avaliação do estado de influenciado, em amostras de sangue. A rapidez com que ocorrem os processos de biotransformação daquelas substancias condiciona a interpretação dos resultados em qualquer estudo toxicocinético. Todavia, os estudos de carácter toxicocinético em consumidores (fumadores) de Cannabis são ainda insuficientes, seja porque não testam todas as amostras biológicas com importância para aquela avaliação, seja porque os métodos analíticos ai utilizados ainda não estão validados em simultâneo para o Δ9-THC e seus metabolitos, na saliva, sangue e urina. Por outro lado, uma vez que a detecção de Δ9-THC-COOH em urina não indica necessariamente estado de influenciado, torna-se importante o estudo da amostra de saliva, de forma a predizer a sua capacidade como indicador de consumo recente de Cannabis. Tais dados ajudariam a interpretação dos resultados, realcando o valor das avaliações do estado de influenciado atraves de amostras de saliva ou, melhor ainda, a utilização desta amostra biológica como matriz de triagem na fiscalização do eventual consumo de substancias psicotropicas, no âmbito da condução rodoviaria. Entre as diferentes metodologias utilizadas para a triagem de canabinóides em amostras biológicas, seja no âmbito do controlo laboral, no controlo rodoviário ou na generalidade dos casos forenses e consequente confirmação dos resultados positivos dessa triagem inicial, tem sido dada importância as tecnicas de cromatografia gasosa (GC) e, mais recentemente, as de cromatografia liquida de alta resolução com espectrometria de massa (LC-MS). Com estas, tem-se procurado alcancar cada vez mais baixos limites de detecção e, ao mesmo tempo, ultrapassar algumas das limitações observadas com outras metodologias existentes. Na Parte I da presente dissertação, faz-se uma introdução geral do assunto, pretendendo-se que a mesma seja uma revisão da literatura relativamente a origem dos canabinóides, seu mecanismo de acção, suas propriedades farmacodinamicas e farmacocinéticas, sua prevalencia e influência a nível da condução rodoviaria e métodos analíticos para a sua determinação em distintas amostras biológicas. Na Parte II, define-se o objectivo geral do presente trabalho, justificando a sua pertinencia: o desenvolvimento e validação de uma metodologia analitica que determine simultaneamente, com sensibilidade, exactidão e precisão, o Δ9-THC e os seus metabolitos, Δ9-THC-OH e Δ9-THC-COOH, em distintas amostras biológicas (saliva, sangue e urina), utilizando um sistema de cromatografia liquida de alta resolução (LC) acoplado a um detector de espectrometria de massa (MS), e sua posterior aplicação a fluidos reais, para a avaliação do consumo e presença de canabinóides nas diferentes amostras biológicas. A parte III divide-se em seis capítulos e descreve, na sequencia do atrás mencionado, os trabalhos experimentais realizados, os resultados obtidos e as conclusões inerentes, constituindo, desta forma, a nossa contribuição pessoal para o esclarecimento do assunto em estudo. O método desenvolvido e validado, por LC-MS, para a detecção, identificação, confirmação e quantificação de Δ9-THC em saliva provou ser especifico e sensivel, com elevados valores de precisão e exactidão e muito bons limites de detecção e de quantificação (1 e 2 ng/ml, respectivamente). Este método poderá ser uma excelente opção em alternativa a utilização da cromatografia gasosa com espectrometria de massa (GC-MS) para a confirmação de resultados de triagem positivos, uma vez que, para alem de permitir quantificar, com exactidão e precisão, concentrações muito reduzidas de Δ9-THC, esta metodologia é menos morosa, ultrapassando algumas desvantagens da metodologia existente por GC-MS. Acresce ainda que o método provou ser selectivo e sensível para um reduzido volume de amostra (500 Ml), o que constitui uma vantagem inequívoca para a realização de analises toxicológicas em saliva. Quando se aplicou a metodologia validada a amostras de saliva de voluntários consumidores de Cannabis e se avaliaram duas formas distintas de colheita de saliva, directamente (expectoração) e por intermédio de dispositivos SalivetteR, concluiu-se que os dispositivos SalivetteR constituem um bom método de colheita de saliva, particularmente porque são uma forma de colheita mais fácil e rápida quando comparada com a expectoração. Contudo, constatou-se que o Δ9-THC se liga fortemente ao algodão do dispositivo, pelo que a sua extracção requer metodologia melhorada. Dado o seu elevado desempenho, este método poderá ser uma clara mais-valia em toxicologia forense quando estiverem em causa estudos apenas em saliva, como acontece no Estudo Europeu em curso e em que Portugal participa (DRUID): determinação de substancias psicotrópicas (incluindo canabinóides) em saliva, no âmbito do controlo rodoviário. Numa segunda fase, foi desenvolvido e validado um método para a detecção, identificação e quantificação simultânea de Δ9-THC, Δ9-THC-OH e Δ9- THC-COOH em amostras de saliva, sangue e urina, e realizado um estudo para estabelecer alguns parâmetros e relações toxicocinéticas entre as três amostras biológicas. A metodologia desenvolvida mostrou elevada especificidade, sensibilidade, precisão e exactidão, podendo ser considerada como uma excelente alternativa ao GC-MS para a detecção, identificação, confirmação e quantificação simultânea de Δ9-THC e Δ9-THC-COOH em amostras de saliva, sangue e urina. Contudo, os elevados limites de detecção alcançados para o Δ9-THC-OH (20 ng/ml), bem como a sua insatisfatória reprodutibilidade e precisão, recomendam a utilização desta metodologia apenas para a detecção, identificação e confirmação deste metabolito em sangue e urina, mas nunca para a sua quantificação. A presença de Δ9-THC ou de Δ9-THC-OH em sangue serão determinantes para a afirmação de consumo recente e de estado de influenciado, uma vez que estes são os compostos activos. O rápido aparecimento do Δ9-THC em sangue durante a sua administração (na experiência, ao fim de 10 minutos), reflectiu uma rápida absorção do Δ9-THC pelas vias aéreas e consequente entrada na circulação geral. No entanto, as concentrações inicialmente obtidas em sangue reduzem-se muito significativamente meia hora a uma hora e meia após fumar, pelo que a correcta determinação de Δ9-THC (única determinante de um estado de influenciado) estará dependente de colheitas rápidas e sequenciais de sangue no período critico do processo de fumar. Também a Cmax sanguínea de Δ9-THC-COOH é atingida muito rapidamente. Todavia, os seus níveis foram já mensuráveis ainda antes do consumo propriamente dito (por ter havido consumo horas antes), ou mesmo elevados nos consumidores habituais que haviam fumado 1 a 3 horas antes da experiência propriamente dita. Tal virá depois a ser analisado em termos toxicocinéticos, permitindo-se a afirmação de que o Δ9-THC-COOH tem uma t1/2 muito elevada e, por isso, poderá vir a ser detectado no sangue até mais de 24 horas depois. Em saliva, apenas foi detectado o Δ9-THC, tendo-se atingido a Cmax imediatamente após fumar, com valores muito elevados mas que diminuem rapidamente (à meia hora), sugerindo a existência de uma contaminação directa da saliva durante o consumo. Esta amostra biológica (aferida a possibilidade de contaminação por consumo passivo) pode ser de grande utilidade para documentar o consumo recente de canabinóides e, a partir dela, eventualmente deduzir sobre o consequente estado de influenciado (em sangue). Com efeito, há semelhanças entre a toxicocinética do Δ9-THC em saliva (marcador de consumo recente) e em sangue (indicador de estado de influenciado), e a forma como se relacionam. Isto é, são semelhantes as respectivas semi-vidas, o que conferira ainda maior valor interpretativo aos resultados positivos obtidos em amostras de saliva. A colheita in situ de saliva, para além de mais fácil na prática, poderá ser um bom método de triagem do consumo de canabinóides, indicativo de consumo recente em face da concentração encontrada, ou inclusivamente preditivo da positividade das amostras sanguíneas. Em urina, apenas foi detectado o metabolito Δ9-THC-COOH durante todo o estudo, e sem correlação com a concentração sanguínea, indicativo de que este metabolito inactivo apenas pode ser utilizado como marcador de consumo de Cannabis, mas nada prediz quanto à existência de um estado de influenciado ou serve para a caracterização temporal em relação ao momento do consumo. Em conclusão, a metodologia aqui desenvolvida e validada permitirá a determinação, em simultâneo e com uma única metodologia cromatográfica, dos diversos canabinóides (Δ9-THC, Δ9-THC-OH e Δ9-THC-COOH) nas distintas amostras biológicas (saliva, sangue e urina). Como técnica de elevado potencial em toxicologia forense, está já hoje a ser aplicada no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P.

Marijuana, hashish and other psychoactive products of the Cannabis sativa, are the most produced and trafficked illicit drugs in the world. Parallel to an increase in Cannabis consumption in the community, an increase in driving under its influence has also been observed. It has been demonstrated that the intoxication produced by these compounds is strongly related to the concentration of its active component, Δ9- THC, this drug being frequently administered with other substances, such as alcohol, thus enhancing the psychoactive effect and the magnitude of the influence on driving abilities. During the last few years, the scientific community, in partnership with some companies involved in the manufacture of drug detection devices, has undertaken to use rapid screening tests on urine for the detection of Δ9-THCCOOH, the major metabolite, in workplace assessments, in drug addiction treatment programs and in road traffic surveillance. However, the detection of Δ9- THC in saliva constitutes a better indication of recent use than urine, being considered possibly the best alternative to blood for registering a recent drug use. Despite this, forensic toxicologists are still requested to determine Δ9- THC, and its metabolites (Δ9-THC-OH and Δ9-THC-COOH) in blood or urine samples, after a given positive in the screening for cannabinoids carried out in saliva or urine, as well as to evaluate the state of impairment obtained by the analysis of blood. The speed of the biotransformation process of these substances to the corresponding metabolites may affect the interpretation of results in any toxicokinetic study. Toxicokinetic studies in Cannabis users (smokers) are still inadequate, either because the studies do not include all the important biological samples, or because there are still no analytical methods able to determine, simultaneously, Δ9-THC and its metabolites in saliva, blood and urine samples. Moreover, given that Δ9-THC-COOH detection in urine does not necessarily indicate impairment, the detection and interpretation of a positive result in saliva is important, in order to predict recent consumption of Cannabis. Such data would help the interpretation of results, enhancing the value of evaluations of impairment through saliva sample analysis, and consequently, the use of this biological sample for onsite drug screening, in roadside traffic control. Forensic toxicology applies different methodologies to cannabinoid screening in different biological matrices. However, for workplace drug controls and control of driving under the influence of drugs, as well as for all forensic cases, it is necessary to perform a confirmation analysis of the positive results obtained, using complex techniques. Nowadays, liquid chromatography techniques with mass spectrometry (LC-MS) are being increasingly introduced in forensic toxicology, as it is becoming more necessary to reach lower detection limits, and to overcome some of the limitations observed with other existing methodologies. In Part I of this thesis, a general introduction of the subject is presented, including a bibliographic review of the origin of cannabinoids, their mechanism of action and consequent pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, their prevalence and influence in driving and methods for their determination in distinct biological samples. In Part II, the general aims of the present study are defined, justifying its relevance: the development and validation of an analytical methodology for the simultaneous determination, with specificity, accuracy and precision, of the active compound of Cannabis, Δ9-THC, and its metabolites, Δ9-THC-OH and Δ9-THCCOOH, in different biological samples (saliva, blood and urine), using a high performance liquid chromatography system (LC) coupled with a mass spectrometry detector (MS) and its application to real samples, for the evaluation of cannabinoid consumption and presence in different biological samples, with a consequent toxicokinetic study. Part III is divided in to six chapters and describes, in the sequence mentioned above, the experimental studies performed, the results and the conclusions achieved, constituting our personal contribution to the clarification of the subject under study. The developed and validated method, with LC-MS for the detection, identification, confirmation and quantification of Δ9-THC in saliva proved to be specific and sensitive, with high values of precision and accuracy and very good limits of detection and quantification (1 and 2 ng/ml, respectively). This method can be an excellent alternative to gas chromatography with mass spectrometry (GC-MS) for the confirmation of a positive screening result since, besides allowing the quantification with accuracy and precision of very low Δ9-THC concentrations, this methodology is less laborious, overcoming some disadvantages of the existing methodology for GC-MS. The method also proved to be selective and sensitive for a reduced sample volume (500Ml), which is a distinct advantage for the accomplishment of toxicological analyses in saliva. When the validated methodology was applied to the saliva samples of Cannabis user volunteers, and two distinct saliva collection procedures (directly through expectoration and through SalivetteR devices) were evaluated, we concluded that the SalivetteR device constitutes a good method for saliva collection, particularly due to its easy collection procedure and efficiency when compared with expectoration. However, we observed that Δ9-THC remains strongly bound to the cotton of the device, which requires an improved methodology. Given its high performance, this method could be of great value in forensic toxicology for saliva studies, as in the current European Study, DRUID, in which Portugal participates: for psychotropic substance determination (including cannabinoids) in saliva, in roadside control assays. The method consecutively developed and validated showed high specificity and selectivity, precision, and accuracy, allowing it to be considered as an excellent alternative to GC-MS for the detection, identification, confirmation and simultaneous quantification of Δ9-THC and Δ9-THC-COOH in saliva, blood and urine samples. However, the high detection limits obtained for Δ9-THC-OH, as well as its unsatisfactory reproducibility, accuracy and precision means that the use of this methodology is only recommended for the detection, identification and confirmation of Δ9-THC-OH in blood and urine, but never for its quantification. The presence of Δ9-THC or Δ9-THC-OH in blood can determine recent consumption and state of impairment, since they are the active compounds. The rapid appearance of Δ9-THC in blood during its administration (during smoking), is a reflection of its efficient and fast absorption through the lungs and consequent entry into the general circulation. However, the initial concentrations in blood are significantly reduced half an hour to one hour after smoking and thus, the correct determination of Δ9-THC (the only way capable of defining the impairment) will depend on sequential and rapid collections of blood during the critical smoking period. Δ9-THC-COOH achieves its maximum concentration (Cmax) in blood very quickly, the concentration before smoking being already measurable, in regular users, and higher than in sporadic consumers, indicative of an additive effect between repeated smoking sessions. In saliva, only the active compound (Δ9-THC) was detected, reaching Cmax immediately after smoking, with very high values that decrease very quickly (in half an hour), suggesting an oral fluid contamination during consumption. This biological sample (taking into account the possibility of contamination by passive consumption) can be of great value for the estimation of recent use of cannabinoids (Δ9-THC) and assessment of a possible state of impairment (in blood). The similarity between Δ9-THC toxicokinetics in saliva (marker of recent use) and in blood (indicative of impairment), and the corresponding correlation, confers a higher interpretive value to the positive results obtained in saliva samples. "In situ" saliva collection, besides being technically easier, can be a good way to screen for cannabinoids, indicative of recent use based on the concentrations found, or even indicative of a positive result in blood. In urine, only the metabolite Δ9-THC-COOH was detected during the study, without a blood correlation, indicating that this inactive metabolite can only be used as a marker of Cannabis use and cannot predict the existence of impairment or determine when consumption occurred. With the developed and validated methodology, excellent results can be obtained to determine, simultaneously, these cannabinoids using a single chromatographic methodology, and in three different biological samples (saliva, blood and urine). This technique has great potential in forensic toxicology, and is already being applied in the Forensic Toxicology Laboratory of the Centre Delegation of the National Institute of Legal Medicine.