Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/7374
Title: Brain-derived neurotrophic factor induced changes in the proteome of cultured hippocampal neurons
Other Titles: Alterações no proteoma de neurónios de hipocampo em cultura induzidas pelo BDNF
Authors: Manadas, Bruno José Fernandes Oliveira 
Orientador: Duarte, Carlos Jorge Alves Bandeira
Fountoulakis, Michael
Keywords: Hipocampo -- efeito das neurotrofinas
Issue Date: 21-Feb-2008
Citation: Manadas, Bruno José Fernandes Oliveira - Brain-derived neurotrophic factor induced changes in the proteome of cultured hippocampal neurons. Coimbra, 2007
Abstract: The hippocampus plays an important role in learning and memory formation, and the cellular and molecular mechanisms involved have been elucidated to some extent. This brain region is particularly vulnerable and is highly affected in stroke episodes. Brain trauma, Alzheimer’s disease and Huntington’s disease are also known to affect the hippocampus. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) belongs to the neurotrophin family of proteins and is known to activate the high-affinity TrkB receptor and the pan-neurotrophin low-affinity receptor p75NTR. BDNF and its cognate receptor, TrkB, are widely expressed in the brain, including the hippocampus, where they play important roles in development, synaptogenesis, regulation of synaptic transmission, and in synaptic plasticity. Furthermore, BDNF plays a neuroprotective role in stroke episodes. In this work we performed a comprehensive study of the effect of BDNF in the proteome of cultured hippocampal neurons, which will contribute to elucidate some of the biological effects of the neurotrophin. The proteome of a mammalian organism exceeds hundreds of thousands of different proteins. The hippocampal proteome is still being mapped, with several studies being conducted aiming at mapping the complement of the genome in this brain region. However, a comprehensive proteomic analysis of the mammalian proteome using conventional broad range two-dimensional gel electrophoresis has been limited by the resolving power of the technique. In order to increase the number of proteins of the hippocampal proteome resolved by 2D-SDS-PAGE, narrow range immobilized pH gradient gels were used in isoelectric focusing together with sample fractionation by ultracentrifugation. Two-dimensional gel electrophoresis is particularly sensitive to contaminants including salts, lipids, nucleic acids, and other non-soluble content (e.g. membrane and membrane-associated proteins). The majority of these interfering components can be removed from protein samples through ultracentrifugation and TCA precipitation followed by acetone washing. However, the protein pellet obtained after TCA precipitation is difficult to solubilize using two-dimensional gel electrophoresis compatible buffers, which results in loss of sample and decrease in the reproducibility of the technique. In order to overcome these two drawbacks, sample (rat brain hippocampus and cultured hippocampal neurons) sonication was introduced to increase sample recovery and improve the reproducibility of two-dimensional gel electrophoresis. This resulted in a better and faster software analysis, with an increase in the number of spots automatically matched across the gel image. BDNF exerts long-term actions on hippocampal neurons through the modulation of protein synthesis mechanisms. However, the changes in the proteome induced by BDNF have only been monitored in a neuroblastoma cell line. Therefore, this work focused on the proteomic changes induced by the neurotrophin in cultured hippocampal neurons upon exposure to BDNF for 12h. In order to evaluate the differential gene expression induced by BDNF, the neurotrophic stimulation was performed in the presence of radiolabelled amino acids, which allows monitoring the expression levels of newly synthesized proteins. The proteomic changes induced by BDNF in cultured hippocampal neurons were mainly analysed using two-dimensional gel electrophoresis of the soluble fraction and the pellet resulting from the ultracentrifugation at 126,000gav (S126), taking advantage of the increased reproducibility achieved. The differential gene expression analysis was performed using gel images of narrow pH ranges (4.5-5.5, 5.0-6.0, 5.5-6.7 and 6.0-9.0) in order to increase the number of detected spots. Proteins from both fractions resolved in all pH ranges were identified using MALDI-TOF mass spectrometry. Once differential expression levels were correlated with protein identification, selected gene products were clustered according to their ontologies. Gene ontologies provide detailed information of gene products based on their molecular function, biological processes and cellular components. Clustering gene products associated with differential expression induced by a specific stimulus allows the functional interpretation of obtained data. Therefore, this approach was used for the evaluation of changes in protein expression induced by BDNF (upregulation and downregulation), retrieving several regulated ontologies, including “carbohydrate metabolism”, “protein metabolism” (“protein biosynthesis” and “translation”) and “nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism” (particularly “RNA processing”). Besides these clusters, several gene products belonging to other ontologies showed changes in expression in response to BDNF stimulation. The S126 fraction represents a protein fraction containing mainly membrane proteins, membrane-associated proteins, and other gene products insoluble in two-dimensional gel electrophoresis buffers. Therefore, another high-throughput proteomic approach, twodimensional liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, was used to increase the proteome coverage of cultured hippocampal neurons and to further investigate the differential gene expression induced by BDNF. This technique resolves peptides and identifies gene products based on the fragmentation pattern of resolved peptides, in contrast with the gel-based approach which resolves proteins. The quantification analysis was performed using the peptide isotope labelling conferred by iTRAQ. The analysis of the identified proteins showed that the gel-based and liquid-based approaches are complementary techniques for the coverage of the proteome of a given species, with several proteins being identified by only one of the methods. In conclusion, the work presented in this thesis provided improved methodologies for resolving complex protein mixtures on two-dimensional gel electrophoresis and twodimensional liquid chromatography, and their identification by mass spectrometry. Several gene products regulated by BDNF were clustered according to their ontologies and the results are expected to contribute as starting points for further analysis of the physiological effects of the neurotrophin, particularly its role in the mechanisms of neuroprotection and brain repair. The diversity of proteins which expression is affected by BDNF may also explain the multiplicity of effects of this neurotrophin in the nervous system. O hipocampo desempenha um papel importante nos processos de aprendizagem e formação de memória, e os mecanismos celulares e moleculares envolvidos neste processo foram ainda apenas parcialmente esclarecidos. Esta região do cérebro é particularmente vulnerável sendo severamente afectada em episódios de trombose cerebral. Nas doenças de Alzheimer e de Huntington, assim como os traumatismos cerebrais, afectam também o hipocampo, ainda que de uma forma menos acentuada. O BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) pertence à família das neurotrofinas, activando receptores de elevada afinidade, do tipo TrkB, e receptores de baixa afinidade, do tipo p75NTR. O BDNF e o seu receptor, TrkB, são expressos abundantemente no cérebro, incluindo no hipocampo, onde desempenham funções importantes no desenvolvimento, sinaptogénese, regulação da transmissão sináptica e na plasticidade sináptica. O BDNF também possui um papel neuroprotector em episódios de trombose cerebral. Neste trabalho efectuou-se um estudo exaustivo dos efeitos do BDNF no proteoma dos neurónios do hipocampo em cultura, com o objectivo de melhor compreender alguns dos efeitos biológicos das neurotrofinas. O proteoma de um mamífero ultrapassa as centenas de milhar de proteínas diferentes. O proteoma do hipocampo ainda não foi concluído, havendo vários estudos a decorrer no sentido de “mapear” o complemento do genoma desta região do cérebro. Uma análise proteómica exaustiva desta região cerebral não poderá ser efectuada por electroforese bidimensional na sua forma convencional com a utilização de géis para focagem isoeléctrica de gama mais alargada, dado que esta abordagem não possui poder de resolução suficiente. Para aumentar a capacidade de resolução de proteínas através de 2D-SDSPAGE neste trabalho foram usados géis com gradiente de pH de apenas uma unidade para a focagem isoeléctrica em combinação com fraccionamento por ultracentrifugação. A electroforese bi-dimensional é particularmente sensível à presença de contaminantes como sais, lípidos, ácidos nucleicos e outras substâncias não solúveis (p.e. proteínas membranares e proteínas associadas à membrana). A maioria das substâncias que interferem com a técnica pode ser removida das amostras proteicas utilizando ultracentrifugação seguida de precipitação por TCA e lavagem com acetona. No entanto, o precipitado proteico que se obtém deste processo é de difícil solubilização quando se utiliza um tampão compatível com a electroforese bi-dimensional, resultando na perda de amostra e diminuição da reprodutibilidade associada à técnica. Para ultrapassar estas desvantagens técnicas, introduziu-se um passo de sonicação da amostra na presença de tampão de solubilização de modo a aumentar a solubilização e melhorar a reprodutibilidade dos géis obtidos. Este processo resultou num melhoramento na qualidade e na velocidade da análise das imagens obtidas a partir dos géis utilizando software apropriado, com um aumento no número de manchas correlacionadas de forma automática em todo o gel. O BDNF exerce acções lentas e duradouras nos neurónios de hipocampo através da modulação dos mecanismos de síntese proteica. Porém, as alterações no proteoma induzidas pelo BDNF apenas foram ainda monitorizadas numa linha celular com origem num neuroblastoma. Neste trabalho foram investigadas as alterações do proteoma induzidas pela neurotrofina em neurónios de hipocampo em cultura, expostos ao BDNF durante 12h. De modo a avaliar a expressão genética diferencial induzida pelo BDNF, o estímulo neurotrófico foi realizado na presença de aminoácidos marcados com enxofre radioactivo. As alterações proteómicas induzidas pelo BDNF em neurónios de hipocampo em cultura foram analisadas recorrendo principalmente à electroforese bidimensional da fracção solúvel e do sedimento obtido após ultracentrifugação a 126,000gme (S126), tirando partido do aumento da reprodutibilidade adquirido. A análise da expressão diferencial foi realizada em géis com uma gama de pH estreita (4.5-5.5, 5.0-6.0, 5.5-6.7, 6.0-9.0) de modo a aumentar o número de spots a serem detectados. As proteínas das duas fracções, resolvidas em todas as gamas de pH apresentadas, foram identificadas utilizando espectrometria de massa (MALDI-TOF). Uma vez correlacionados os níveis de expressão diferencial com a identificação das proteínas, os produtos dos genes apresentando alterações de expressão foram agrupados de acordo com as suas ontologias. As ontologias dos genes permitem caracterizar os produtos dos genes com base na sua função molecular, processo biológico ou componente celular do qual fazem parte. O agrupamento dos produtos de genes cuja abundância é afectada em resposta a um determinado estímulo contribui para a interpretação funcional dos dados obtidos. Assim, esta abordagem foi utilizada para avaliar as alterações induzidas pelo BDNF na expressão de proteínas (aumento e diminuição da expressão) em neurónios do hipocampo em cultura tendo retribuído várias ontologias que são reguladas pelo BDNF: “metabolismo dos hidratos de carbono”, “metabolismo proteico” (“biosíntese de proteínas” e “tradução”) e “metabolismo das bases nucleicas, nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos” (particularmente “processamento de RNA”). Para além destas ontologias, outras proteínas pertencentes a outras ontologias mostraram ser reguladas em resposta ao estímulo com BDNF em neurónios do hipocampo em cultura. A fracção S126 contém principalmente proteínas membranares, proteínas associadas à membrana e outras proteínas insolúveis nos tampões utilizados na electroforese bidimensional. Por isso, foi utilizada outra abordagem para análise em larga escala do proteoma contido nesta fracção, a cromatografia bidimensional acoplada a espectrometria de massa com fragmentação, de forma a aumentar a cobertura do proteoma dos neurónios de hippocampo em cultura e permitir a investigação da expressão diferencial dos genes induzida pelo BDNF. Esta técnica permite o fraccionamento de péptidos e identifica os produtos da expressão dos genes com base no padrão de fragmentação dos péptidos separados por cromatografia, ao contrário da abordagem com base em separação em gel, que permite a separação de proteínas. A análise quantitativa foi realizada utilizando a marcação isotópica dos péptidos conferida pelo iTRAQ. A análise das proteínas identificadas levou-nos a concluir que as abordagens líquida e em gel são técnicas complementares para a cobertura do proteoma de uma dada espécie, tendo-se observado a identificação de várias proteínas por apenas um dos métodos. No seu conjunto, o trabalho apresentado nesta tese permitiu melhorar as metodologias utilizadas na análise do proteoma do hipocampo, utilizando electroforese bi-dimensional e cromatografia bi-dimensional, com a identificação de proteínas por espectrometria de massa. Foi possível agrupar vários produtos de genes regulados pelo BDNF de acordo com as suas ontologias, e os resultados obtidos poderão constituir pontos de partida para uma análise dos efeitos fisiológicos da neurotrofina, em particular do seu papel nos mecanismos de neuroprotecção e reparação cerebral. A diversidade de proteínas que revelaram alterações na sua expressão induzidas pelo BDNF poderá explicar a multiplicidade dos efeitos desta neurotrofina no sistema nervoso.
Description: Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia de Coimbra
URI: https://hdl.handle.net/10316/7374
Rights: openAccess
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