Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/36139
Title: Desenvolvimento de um biossensor para a deteção de óxido nítrico
Authors: Rodrigues, Marcelo Francisco Ribeiro dos Santos 
Orientador: Barbosa, Rui M.
Keywords: Óxido nítrico; Técnicas biossensoriais
Issue Date: Sep-2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Descoberto nos anos 80s como poluente ambiental devido à formação de espécies reativas de oxigénio e azoto (RONS), o óxido nítrico (NO) despertou maior interesse por parte da comunidade científica devido aos vários processos de sinalização em que está envolvido nos tecidos biológicos. O óxido nítrico é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) que promove a conversão de L-arginina a L-citrulina e NO na presença de inúmeros cofatores (BH4, NADPH, FAD, O2). As particulares características da molécula de óxido nítrico pressupõem a falta de interações específicas com os recetores membranares, o que lhe confere uma grande versatilidade para reações com alvos biológicos. A complexidade das reações com os seus alvos biológicos pode variar desde reações de segunda ordem irreversíveis à formação reversível do complexo nitrosilo. O NO pode modificar a atividade reguladora de proteínas por reação direta com o seu grupo heme ou indireta via S-nitrosilação e nitração dos resíduos de tirosina. Devido à abundância no meio fisiológico, as proteínas hémicas ferrosas adquirem um papel fundamental na compreensão do papel do óxido nítrico. No cérebro, a sua atuação como neuromodulador está intrinsecamente ligado à ativação do recetor de glutamato dependente de cálcio presente nos neurónios. A isoforma neuronal produz NO no tecido nervoso, tanto central como periférico e realiza um papel na comunicação celular ao associar-se com a membrana plasmática. O alvo melhor caracterizado para o NO é a sGC que por vezes é considerada um recetor específico para NO devido à diminuta interação com os interferentes do NO (O2 e CO). Apesar do seu curto tempo de meia vida e baixa concentração, a possibilidade da quantificação do NO in vivo e ex vivo revela-se um passo crucial na compreensão dos mecanismos a si inerentes. É portanto necessário o desenvolvimento de ferramentas metodológicas capazes de determinar de forma robusta os níveis de NO nos sistemas biológicos. Enquanto os métodos indiretos quantificam o NO segundo os seus produtos de oxidação/redução (colorimetria, EPR, etc), as técnicas eletroquímicas possibilitam uma quantificação direta e em tempo real do NO. Os microsensores acrescentam uma melhor resolução espacial com mínimos danos para os tecidos. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento de microeléctrodos de fibra de carbono para a quantificação de NO através da imobilização de proteínas hémicas. Após resultados preliminares com mioglobina, microperoxidase e hemina em eléctrodos de screen-printig e carbono vítreo, a hemina foi a macromolécula que reuniu as melhores condições eletroquímicas para o estudo sistemático em microeléctrodos. 10 A ligação covalente da hemina com MWNTs e quitosano com o agente cross-linking EDC foi o protocolo mais robusto no que diz respeito ao DET e estabilidade para a medição de NO. Os picos redox do par Fe2+/Fe3+ foram determinados por voltametria cíclica com um valor médio de 3.82 ± 1.95 nA V-1 s enquanto o potencial de redução do NO foi determinado por voltametria de onda quadrada a -0.762 ± 0.011 V na presenção de O2 e a - 0.719 ± 0.012 V na ausência de O2. Os microsensores hemina/MWNTs/Quit-EDC foram ainda caracterizados em termos de sensibilidade a NO, 1.72 ± 0.67 e 2.61 ± 1.67 nA/μM na presença e ausência de O2. O seu limite de deteção foi muito semelhante para ambos os meios, 25 ± 15 nM em meio anaeróbico e 26 ± 15 nM em meio aeróbio. Após a caracterização dos eléctrodos procedeu-se à quantificação de NO exógeno in vivo em cérebro de rato. Os valores obtidos estão de acordo com a calibração prévia do eléctrodo, o que demostra que o filme de MWNTs/Hemina/Quit-EDC mantém as suas características físico-química após a sua inserção em meio biológico.
Discovered in the 80s as an environmental pollutant due to the formation of reactive species of oxygen and nitrogen (RONS), nitric oxide (NO) attracted significant interest from the scientific community due to various signaling processes that are involved in biological tissues. Nitric oxide is synthesized by nitric oxide synthase (NOS) that promotes the conversion of L-arginine to L-citrulline and NO in the presence of various cofactors (BH4, NADPH, FAD, O2). The particular characteristics of the nitric oxide molecule presume the absence of specific interactions with membrane receptors, which gives great versatility for reaction with biological targets. The complexity of their reactions with biological targets can range from irreversible second-order reactions to the reversible formation of the nitrosyl complex. NO can modify the activity of regulatory proteins by direct reaction with their heme or indirect via S-nitrosylation and nitration of tyrosine residues. Due to the abundance in physiological media, the ferrous hemic proteins acquire a key role in understanding the role of nitric oxide. In the brain, acting as a neuromodulator is intrinsically linked to the activation of glutamate calcium-dependent receptor present in neurons. The neuronal isoform produces NO in nervous tissue, both central and peripheral, and performs a role in cellular communication by associating with the plasma membrane. The best characterized target for NO is sGC which is sometimes considered a receptor specific for NO due to the very small interaction with the NO interferings (CO and O2). Despite its short half life and low concentration, the possibility of quantification of NO "in vivo" and "ex vivo" proves to be a crucial step in understanding the mechanisms inherent to itself. It is therefore necessary to develop methodological tools able to robustly determine the levels of NO in biological systems. While indirect methods quantify the NO products according to their oxidation / reduction (colorimetry, EPR, etc.), the electrochemical techniques allow quantification of direct and real-time NO. The microsensors add a higher spatial resolution with minimal damage to tissue. The main aim of the work was to develop carbon fiber microelectrodes for NO measurement by hemic protein’s immobilization. After preliminary results with myoglobin, microperoxidase and hemin in screen-printig and glassy carbon electrodes, hemin was the macromolecule that gathered the best electrochemical conditions for the systematic study in microelectrodes. Covalent attachment of chitosan and hemin MWNTs with the cross-linking agent EDC protocol was more robust with respect to DET and stability for NO measurement. The peaks redox pair Fe2 + / Fe3 + were determined by cyclic voltammetry with 12 an average value of -3.82 ± 1.95 nA V-1 s while the reduction potential of NO was determined by square wave voltammetry at -0762 ± 0011 V in the presence of O2 and - 0719 ± 0012 V in the absence of O2. The microsensors hemin / MWNTs / Quit-EDC were further characterized in terms of sensitivity to NO, 1.72 ± 0.67 and 2.61 ± 1.67 nA / mM in the presence and absence of O2. Its detection limit was very similar for both media, 25 ± 15 in anaerobic and 26 ± 15 nM in an aerobic medium. The characterization of electrodes was proceeded by the quantification of exogenous NO "in vivo" in rat brain. The values obtained are in agreement with previous calibration of the electrode, which demonstrates that the film MWNTs / hemin / EDC-Quit maintains its physical and chemical characteristics after insertion in a biological environment.
Description: Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/36139
Rights: openAccess
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