Ectomycorrhizal associations of edible fungi and Cistus spp.: from eld studies to in vitro synthesis

Abstract

Edible mushrooms are consumed globally whether as a delicacy or due to their medicinal and nutritional proprieties. As a seasonal resource, wild edible mushrooms are not available naturally during all year, existing, therefore, a need on their cultivation. Some ectomyc- orrhizal (ECM) fungi produce the most sought and valuable sporocarps worldwide. Unlike saprotrophic species, a pro table cultivation of edible mycorrhizal mushrooms is very diffi- cult due to several issues, being its association with ne roots of plants, dependency of plant partner's biomass and growth rates some of them. Several species of the Mediterranean genus Cistus are common shrubs in the understory of Pinus pinaster dominated forests in Portugal and are ectomycorrhizal species. Besides their ability of establishing ectomycorrhizas, Cistus are also shrubs with relative high growth rates, capable of reach their highest biomass in less time than trees, being suitable candidates for cultivation of ectomycorrhizal mushrooms. One of the main objectives, of the present work, is the production of edible ECM mush- rooms, thus were performed assays with mycelial cultures of ECM species as well as synthesis of ectomycorrhizas. Fungal mycelial cultures were newly isolated from sporocarps of edible ectomycorrhizal species - Boletus fragans and Tricholoma equestre- and compared with the saprobic species Pleurotus ostreatus and Agaricus bisporus. The mycelial cultures were grown in several cul- ture media - Potato Dextrose agar (PDA), Malt extract agar (MEA), Biotin-Aneurin-Folic acid (BAF), Merlin-Norkrans modi ed medium (MNM) and Murashige & Skoog medium (MS) - and different temperatures, 4oC/24oC/30oC. Growth responses of ECM and sapro- trophs fungi were compared. The experiment allowed also the establishment of optimal culture conditions for mycelial growth of each species. Seedlings of three Portuguese native species - Cistus psilosepalus, Cistus salviifolius and Cistus ladanifer - were used as plant partners to axenically induce the establishment of mycor- rhizas with the edible ECM fungal species Boletus fragans, Lactarius deliciosus, Tricholoma equestre and Tricholoma portentosum. Different methods for mycorrhizal synthesis were tested, including containers with different shapes and several substrates and, to our knowl- edge, a new method of ectomycorrhizal synthesis, adapted to these shrubs growth habit, was developed. In order to get some insights about the ECM fungal partners of Cistus plants in natural conditions, a preliminary sampling was performed in a maritime pine forest. Ectomycorrhizal root tips from Cistus psilosepalus, Cistus salviifolius and Pinus pinaster were collected ina natural Portuguese pinewood to identify natural fungal symbionts associated with these plants and sharing of fungal partners between P. pinaster and Cistus spp. ECM root tips were sorted into morphological groups, photographed and symbiotic fungi were molecularly identi ed by ampli cation and sequencing of fungal ITS region (Internal Transcribed Spacer). ECM fungi showed having in general lower growth rates than saprobic fungi, as expected due to their life styles. The optimal temperature for almost all species was 24oC being sub- sequently the best temperature when producing spawn for cultivation of saprobic fungi and fungal inoculum for mycorrhizal synthesis. The only exception was P. ostreatus that grew better at 30oC. The culture medium PDA demonstrated to be the most suitable medium for axenic growth of all fungi, being a nutritional comprehensive medium ful lling the require- ments of fungi of different lifestyles. It was also proved the growth of almost all fungi in MS medium, mainly used to grow plant tissues. Ectomycorrhizas were formed, using the novel technique, in almost all mycorrhizal fungus- plant combinations. The novel technique showed in many different ways to be very useful in testing partners compatibility as well as in monitoring mycorrhizal development. Moreover, results suggest a clear plasticity of these shrubs concerning their fungal partners diversity. Several species were found associated naturally with Cistus spp. as well as sharing of fungal symbionts between Cistus salviifolius and P. pinaster. Moreover, were also found species that produce edible mushrooms associated with Cistus sp., showing these shrubs' potential to produce edible sporocarps. Results are discussed in relation to optimize methods for culture and synthesis of ecto- mycorrhizas, to understand the future application of these relationships in using mycorrhized shrubs with edible fungi as inoculum source to naturally guide pinewoods towards cultivation of a speci c edible ectomycorrhizal mushroom as well as in using Cistus shrubs to produce edible mushrooms.

Os cogumelos comest veis s~ao consumidos por todo o mundo ora como uma iguaria, ora devido as suas propriedades nutricionais e medicinais. Alguns dos mais apreciados e valoriza- dos cogumelos silvestres comest veis s~ao os carp oforos de fungos ectomicorr zicos (ECM) pelo que o interesse econ omico no seu cultivo enorme. No entanto, o cultivo economicamente rent avel de cogumelos micorr zicos comest veis e muito dif cil, contrariamente as esp ecies de fungos sapr o tas, devido, nomeadamente a necessidade de associa c~ao com ra zes de plantas e a depend^encia das taxas de crescimento e biomassa do seu simbionte vegetal. Um dos objectivos deste trabalho e a produ c~ao de cogumelos comest veis de esp ecies ECM, pelo que se realizaram ensaios com culturas de mic elio das esp ecies f ungicas e de s ntese de ectomicorrizas. Foram isoladas culturas de mic elio a partir de carp oforos das esp ecies ectomicorr zicas comest veis - Boletus fragans e Tricholoma equestre - e, para compara c~ao, das esp ecies sapr o tas Pleurotus ostreatus e Agaricus bisporus. As culturas de mic elio foram colocadas a crescer em diferentes meios de cultura - Potato Dextrose agar (PDA), Malt extract agar (MEA), Biotin-Aneurin-Folic acid (BAF), Merlin-Norkrans modi ed (MNM) e Murashige & Skoog (MS) - e em diferentes temperaturas, 4oC/24oC/30oC. As respostas de crescimento dos fungos ECM e dos sapr o tas foram comparadas. Foi tamb em poss vel determinar as condi c~oes optimas de cultura para o crescimento de mic elio para cada esp ecie testada. As esp ecies vegetais utilizadas como simbionte dos fungos ectomicorr zicos pertencem ao g enero mediterr^anico Cistus (famlia Cistaceae). E conhecido serem esp ecies ectomicorr zicas e s~ao comuns no sub-bosque dos pinhais dominados por pinheiro-bravo (Pinus pinaster) em Portugal. Para al em da capacidade de estabelecerem ectomicorrizas, os Cistus s~ao arbustos e como tal, capazes de atingir a sua biomassa m axima em menos tempo que as arvores, sendo, por isso, candidatos adequados para o cultivo de cogumelos ectomicorr zicos. Para a s ntese de ectomicorrizas foram usadas pl^antulas de tr^es esp ecies espont^aneas de Portugal - Cistus psilosepalus, Cistus salviifolius e Cistus ladanifer - e as de fungos ectomi- corr zicos comest veis Boletus fragans, Lactarius deliciosus, Tricholoma equestre e Tricholoma portentosum. Foram testados diferentes m etodos para a s ntese de micorrizas incluindo re- cipientes com diferentes formas e diferentes substratos e foi desenvolvido um novo m etodo, tanto quanto sabemos, para a s ntese de ectomicorrizas adaptado ao h abito de crescimento destes arbustos. Para conhecer a comunidade de fungos ectomicorr zicos simbiontes de Cistus em condi c~oesnaturais, foi feita uma amostragem preliminar num pinhal de pinheiro-bravo. Foram colhi- das ra zes de Cistus psilosepalus, Cistus salviifolius e de Pinus pinaster num pinhal da zona costeira. A inclus~ao de P. pinaster neste estudo visou identi car os simbiontes f ungicos naturais associados, simultaneamente, com Cistus sp. e P. pinaster. No laborat orio as pon- tas ectomicorr zicas foram separadas em grupos morfol ogicos e fotografadas. Os simbiontes f ungicos foram identi cados molecularmente atrav ez da ampli ca c~ao e sequencia c~ao da regi~ao ITS (internal transcribed spacer). Os fungos ECM mostraram ter, em m edia, taxas de crescimento mais baixas compar- ativamente aos sapr o tas, como seria de esperar devido aos seus modos de nutri c~ao. A temperatura optima para quase todas as esp ecies f ungicas foi de 24oC, sendo, desta forma, a temperatura mais adequada para a produ c~ao de in oculo para a s ntese de micorrizas, assim como de "semente" para o cultivo de fungos sapr o tas. A unica excep c~ao foi o P. ostrea- tus que cresceu melhor a 30oC. O meio de cultura PDA demonstrou ser o mais adequado para o crescimento ax enico de todos os fungos, sendo, portanto, um meio nutricionalmente abrangente que preenche os requisitos de grupos de fungos com modos de nutri c~ao difer- entes. Foi tamb em comprovado o crescimento de quase todos os fungos testados no meio MS - desenvolvido e usado maioritariamente para o crescimento de tecidos vegetais. Registou-se a forma c~ao de ectomicorrizas, em quase todas as combina c~oes fungo-planta, com o uso da nova t ecnica. A nova t ecnica mostrou ser util, de diferentes formas, tanto na monitoriza c~ao do desenvolvimento de micorrizas, como para testar a compatibilidade entre parceiros. Para al em disso, os resultados obtidos sugerem uma evidente plasticidade das esp ecies de Cistus no que respeita a diversidade de parceiros f ungicos. Relativamente a comunidade de simbiontes f ungicos ECM foi poss vel identi car um el- evado n umero de esp ecies encontradas naturalmente associadas com Cistus spp., apesar da reduzida amostragem realizada. Foi tamb em encontrada partilha de esp ecies f ungicas entre Cistus salviifolius e P. pinaster. A identi ca c~ao (at e ao momento) de uma esp ecie produtora de cogumelos comest veis naturalmente associada com Cistus sp. evidencia o potencial destes arbustos para a produ c~ao de carp oforos comest veis. Os resultados s~ao discutidos no sentido da optimiza c~ao dos m etodos para a cultura e s ntese de ectomicorrizas e tamb em com vista a aplica c~ao futura destas rela c~oes no uso dosarbustos micorrizados como fonte de in oculo para guiar, de forma natural, pinhais no sentido do cultivo de um determinado cogumelo ectomicorr zico, assim como usar os Cistus para produzir cogumelos comest veis.