Unravelling the role of ataxin-2 in the hypothalamus: a new player in metabolism

Abstract

The hypothalamus has several physiological functions, namely as a sensor of the whole-body nutritional status and metabolic regulator. The hypothalamus, as an appetite regulator, plays a relevant role in the development of metabolic alterations, such as obesity and insulin resistance. On the other hand, obesity changes hypothalamic physiology. For this reason, understanding the mechanisms of hypothalamic function, more specifically of the arcuate nucleus, might contribute for the discovery of new therapeutic approaches for the treatment of insulin resistance or obesity. Ataxin-2 is an ubiquitous protein that is present in the hypothalamus and it has relevant role in several cellular mechanisms, such as RNA metabolism, cellular stress response, endocytosis and cytoskeleton organization. Previous work showed that ataxin-2 knockout mice are obese, have dyslipidaemia and insulin resistance. Moreover, ataxin-2 is involved in several physiological functions regulated by the hypothalamus, such as circadian rhythm and stress response. However, to this date, the role of ataxin-2 in the hypothalamus was never investigated. The first aim of this work was to unravel the role of ataxin-2 in the hypothalamus in the regulation of appetite, body weight and energy homeostasis in mice. For this purpose, we specifically silenced ataxin-2 in the arcuate nucleus of the hypothalamus of C57BL/6 mice, by stereotaxic injection of lentiviral vectors encoding for a short-hairpin targeting ataxin-2. The results show that mice with ataxin-2 silencing in the arcuate nucleus consume more food (hyperphagia), and are obese and insulin resistant. Furthermore, these mice have higher levels of inflammation and gliosis markers (TNF- , IL-1 , TGF1 , GFAP e SOCS3 in the hypothalamus), have lipid accumulation in the liver, increased white adipose tissue content and larger lipid droplets in brown adipose tissue. These results suggest that silencing ataxin-2 in the hypothalamus has similar effects as high fat diet (HFD). Mice fed with a HFD (45% fat) for 4 weeks have lower levels of ataxin-2 in the hypothalamus, when compared to mice fed with a chow diet. Therefore, the second aim of this work was to investigate whether the reestablishment of ataxin-2 in the hypothalamus could improve or decrease the obesity and insulin resistance induced by HFD. In order to specifically increase ataxin-2 levels in the hypothalamus, we stereotaxically injected lentiviral vectors encoding for ataxin-2 in mice arcuate nucleus. This reestablishment of ataxin-2 in hypothalamic arcuate nucleus prevented HFD-induced obesity and improved insulin sensitivity, reduced inflammatory markers in the hypothalamus and decreased lipid accumulation in the liver, white and brown adipose tissue. Previous studies showed that ataxin-2 knockout mice are insulin resistant. Therefore, the third aim of this work was to evaluate if the specific reestablishment of ataxin-2 in the hypothalamus of ataxin-2 knockout mice could improve insulin sensitivity. Using the same approach as previously described, we restored ataxin-2 expression in the arcuate nucleus of the hypothalamus of ataxin-2 knockout mice. The results showed that ataxin-2 knockout mice with reestablishment of ataxin-2 in the hypothalamus have improved insulin sensitivity. Furthermore, we observed that the ataxin-2 knockout mice have dysfunction of circadian behaviour and altered levels of clock genes (Bmal1, CLOCK e Per2) in the hypothalamus. The reestablishment of ataxin-2 in the hypothalamus of these mice restored clock genes expression. To evaluate the role of ataxin-2 in insulin signalling, we modulated ataxin-2 levels in vitro in a cellular model of mouse hypothalamic neurons (mHypo-N42) in an insulin resistance paradigm induced by palmitate. We observed a decrease in ataxin-2 and a overactivation of the mTOR pathway in this model of insulin resistance. Additionally, the overexpression of ataxin-2 decreased the activation of mTOR signalling pathway effectors, which is related to an amelioration of insulin resistance deleterious effects. Overall, the results of this thesis show that ataxin-2 has a relevant role in hypothalamic mediated metabolic regulation. Ataxin-2 changed body weight and metabolic homeostasis suggesting ATXN2 gene as a potential obesity gene. Since obesity decreases ataxin-2 levels and this promotes metabolic dysfunction, we propose the reestablishment of ataxin-2 levels as a potential therapeutic approach for obesity and related metabolic disorders.

O hipotálamo desempenha diversas funções fisiológicas, nomeadamente como sensor do estado nutricional e regulador metabólico. O hipotálamo, como regulador do apetite, é ainda relevante no desenvolvimento de alterações metabólicas como a obesidade e resistência à insulina. Por outro lado, a obesidade altera a fisiologia do hipotálamo. Assim, o estudo de novos mecanismos envolvidos na função do hipotálamo no controlo da homeostase metabólica, mais especificamente no núcleo arqueado, pode contribuir para a descoberta de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da resistência à insulina ou da obesidade. A ataxina-2 é uma proteína ubíqua que está presente no hipotálamo e que está envolvida em diversos mecanismos celulares como o metabolismo do RNA, resposta celular ao stress, endocitose e organização do citoesqueleto. Trabalhos anteriores mostraram que murganhos “knockout” para a ataxina-2 eram obesos, apresentando dislipidémia e resistência à insulina. Adicionalmente, a ataxina-2 está envolvida em várias funções fisiológicas controladas pelo hipotálamo, como o ritmo circadiano e resposta ao stress. No entanto, até há data, o papel da ataxina-2 no hipotálamo nunca foi investigado. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar o papel da ataxina-2 no hipotálamo na regulação do apetite, peso corporal e homeostase energética em murganhos. Para tal, o gene da ataxina-2 foi especificamente silenciando, no núcleo arqueado do hipotálamo de murganhos C57BL/6, recorrendo a uma injeção esterotáxica com vetores lentivirais que codificam para um short-hairpin que tem como alvo a ataxina-2. Os resultados mostram que os animais com silenciamento da ataxina-2 no núcleo arqueado consomem mais comida (hiperfagia), são obesos e resistentes à insulina. Além disso, apresentaram marcadores de inflamação no hipotálamo (TNF- , IL-1 , TGF1 , GFAP e SOCS3), acumulação de lípidos no fígado, aumento da quantidade de tecido adiposo branco e aumento de gotas lipídicas no tecido adiposo castanho. Os resultados obtidos mostram que o silenciamento da ataxina-2 no hipotálamo tem efeitos semelhantes a uma dieta rica em lípidos. Por outro lado, murganhos alimentados durante 4 semanas com uma ração rica em lípidos (45% gordura) têm menor quantidade de ataxina-2 no hipotálamo, em comparação a murganhos mantidos em ração normal. Assim, o segundo objetivo deste trabalho foi investigar se o restabelecimento dos níveis de ataxina-2 no hipotálamo nos murganhos alimentados com ração rica em lípidos poderia melhorar ou diminuir o estado de obesidade e resistência à insulina. Os níveis de ataxina-2 no hipotálamo de murganhos foram aumentados utilizando vetores lentivirais que codificam para a ataxina-2. O restabelecimento dos níveis de ataxina-2 no núcleo arqueado do hipotálamo preveniu a obesidade causada pela dieta rica em lípidos e melhorou a sensibilidade à insulina, diminuiu os marcadores de inflamação no hipotálamo e diminuiu a acumulação de lípidos no fígado, tecido adiposo branco e castanho. Outros estudos mostraram que os murganhos “knockout” para a ataxina-2 são resistentes à insulina. Assim, o terceiro objetivo deste trabalho consistiu em avaliar se o restabelecimento especifico dos níveis de ataxina-2 no hipotálamo dos animais “knockout” para a ataxina-2 promoveria um aumento na sensibilidade à insulina. Utilizando a mesma estratégia referida anteriormente, os níveis de ataxina-2 foram especificamente restabelecidos no núcleo arqueado do hipotálamo de murganhos “knockout” para a ataxina-2. Os resultados obtidos mostraram que a expressão hipotalâmica de ataxina-2 diminuiu a resistência à insulina destes animais. Adicionalmente, observamos os murganhos “knockout” para a ataxina-2 apresentaram perturbações no comportamento circadiano e alterações na expressão de genes relógio (Bmal1, CLOCK e Per2) no hipotálamo. O aumento da expressão de ataxina-2 no hipotálamo restaurou os níveis de expressão dos genes relógio. Com o objetivo de avaliar o papel da ataxina-2 na sinalização da insulina, modulamos os níveis de ataxina-2 in vitro numa linha celular de neurónios hipotalâmicos de murganho (mHypo- N42) num paradigma de resistência à insulina. Observamos uma diminuição nos níveis de ataxina-2 e um aumento em fatores da via metabólica do mTOR, neste modelo de resistência à insulina induzida pelo palmitato. Adicionalmente, a sobrexepressão de ataxina-2 promoveu a diminuição da ativação de mediadores da via do mTOR, o que traduz uma reversão nos efeitos da resistência à insulina. Em conclusão, os resultados desta tese mostram que a ataxina-2 tem um papel relevante na regulação hipotalâmica do metabolismo. O impacto da ataxina-2 no peso corporal e na homeostase metabólica sugerem que o gene ATXN2 poderá estar relacionado com obesidade. Considerando que a obesidade diminui os níveis de ataxina-2 no hipotálamo, o que promove disfunção metabólica, propomos que o restabelecimento dos níveis de ataxina-2 como uma possível abordagem terapêutica para a obesidade e consequentes alterações metabólicas.