Characterisation of a multiple sclerosis animal model - behaviour and biochemical effects of cuprizone intoxication, in a DPP-IV centred approach

Abstract

Introduction: Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory immune-mediated disease of the central nervous system mainly characterized by degeneration of neurons’ myelin sheath (demyelination). Recently, it has been suggested that glucagon-like peptide-1 (GLP-1), one of the main substrates of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV), exerts neuroprotective and neurotrophic properties. However, changes on the DPP-IV–GLP-1 pathway remain to be characterized in MS, including in animal models of the disease, such as the cuprizone (CPZ)induced demyelination mouse model. Aims: This study aimed to characterize behaviour and biochemical profiles associated with CPZ-induced demyelination followed by spontaneous remyelination due to toxin withdrawal, focusing on markers of neurotoxicity, demyelination, inflammation and DPP-IV/GLP-1 pathway. Methods: Two male C57BL/6 mice groups (n=10 each) were fed with an oral solution of CPZ (0.2%) during 5 weeks (W5); after that, half of them (n=10) were maintained on vehicle (water) for two more weeks (W7), which allowed the definition of two relevant milestones: W5 for the peak of demyelination and W7 for the early stage of spontaneous remyelination. A vehicle (water)-treated group was used as control (n=10 for each time-point). At weeks 5 and 7, animals were subjected to behaviour experiments (Y-maze, open-field and splash tests). Additionally, gene and/or protein expression of GFAP, myelin-PLP, TNF-α, IL-1β, DPP-IV, GLP-1 and GLP-1R was accessed in cerebellum (through RT-PCR and WB) and in corpus callosum samples (by IHC). Results: Behavioural tests confirmed a depression-related behaviour (splash test) and a trend to changes on parameters of anxiety (open field test) in the CPZ-treated mice. Myelin-PLP expression was decreased in the cerebellum and corpus callosum of CPZ-treated mice at the peak of demyelination (week 5), when compared with the control animals; these changes were reversed at week 7 (early remyelination phase). The CPZ-induced animal model of MS was able to mimic the gliosis component of the disease, revealed by the significantly increased GFAP protein expression during the demyelination phase, with recovered values in the early remyelination phase. Furthermore, a reversible inflammatory process, revealed by the overexpression of the cytokines TNF-α and IL-1β at week 5 (peak of demyelination), was – x – observed in this model, with normalized values at week 7 (early remyelination). Lastly, although unchanged expression of DPP-IV and GLP-1 was found in the cerebellum of CPZtreated mice in weeks 5 and 7, there was an overexpression of DPP-IV in the corpus callosum and a reduced expression of GLP-1R in the cerebellum at the peak of demyelination. Conclusions: The behavioural and biochemical changes observed are consistent with the temporal profile of demyelination and remyelination processes in this animal model of MS. The pattern of DPP-IV, GLP-1 and GLP-1R expression in the cerebellum and in the corpus callosum maintains intact the possibility to use this pathway as an interesting and relevant therapeutic target in MS. Further studies are mandatory to complement our preliminary data.

Introdução: A esclerose múltipla (EM) é uma doença crónica inflamatória imuno-mediada do sistema nervoso central, caracterizada pela degeneração da bainha de mielina (desmielinização) dos neurónios. Recentemente, foi sugerido que o peptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-1), um dos principais substratos da dipeptidil peptidase IV (DPP-IV), exerce propriedades de neuroprotecção e neurotróficas. No entanto, alterações na via DPP-IV–GLP-1 permanecem por caracterizar na EM, incluindo em modelos animais da doença, como o modelo animal de desmielinização induzida por cuprizona (CPZ). Objectivos: Este estudo teve como objectivo caracterizar os perfis comportamental e bioquímico associados a desmielinização induzida por CPZ e subsequente remielinização provocada pela remoção da toxina, com enfoque em marcadores de neurotoxicidade, desmielinização, inflamação e da via DPP-IV/GLP-1. Métodos: Dois grupos de murganhos C57BL/6 machos (n=10 cada) foram alimentados com uma solução oral de CPZ (0,2%) durante 5 semanas (W5); seguidamente, metade dos animais (n=10) foram mantidos em tratamento com o veículo (água) durante mais duas semanas (W7), o que permitiu a definição de dois marcos temporais: W5 para o pico de desmielinização e W7 para a fase inicial de remielinização. Um grupo tratado com o veículo (água) foi usado como controlo (n=10 para cada tempo de estudo). Após 5 e 7 semanas, os animais foram sujeitos a ensaios de comportamento animal (testes Y-maze, open field e splash). Adicionalmente, a expressão génica e/ou proteica de GFAP, PLP-mielina, TNF-α, IL-1β, DPP-IV, GLP-1 e GLP1R foi analisada em amostras de cerebelo (através de RT-PCR e WB) e de corpo caloso (por IHC). Resultados: Os testes comportamentais confirmaram a existência de um comportamento do tipo depressivo (teste splash) e alterações nos parâmetros de ansiedade (teste open field) nos animais tratados com CPZ. A expressão da PLP-mielina diminuiu no cerebelo e no corpo caloso nos animais tratados com CPZ no pico de desmielinização (semana 5), quando comparada com os animais controlo; estas alterações foram revertidas às 7 semanas (fase de remielinização precoce). O modelo animal de EM induzida por CPZ mimetizou a componente gliótica da doença, revelada pelo aumento de expressão de GFAP durante a fase de desmielinização, com recuperação na fase de remielinização precoce. Para além disso, o modelo permitiu constatar a – xii – existência de um processo inflamatório, revelado pela expressão elevada das citoquinas TNFα e IL-1β, na semana 5 (pico de desmielinização), com valores normalizados às 7 semanas (fase precoce de remielinização). Por fim, apesar da expressão inalterada de DPP-IV e GLP-1 encontrada no cerebelo dos animais nas semanas 5 e 7, observou-se uma expressão elevada de DPP-IV no corpo caloso e diminuída de GLP-1R no cerebelo no pico de desmielinização. Conclusões: As alterações comportamentais e bioquímicas observadas são consistentes com o perfil temporal dos processos de desmielinização e remielinização neste modelo animal de EM induzida por CPZ. O perfil de expressão de DPP-IV, GLP-1 e GLP-1R no cerebelo e no corpo caloso mantém intacta a possibilidade de usar esta via como um alvo terapêutico interessante e relevante na EM. Estudos posteriores são necessários para complementar esta informação preliminar.