Lipid profile and lipogenic capacity of the seaweed Ulva lactuca (Chlorophyta). Use as potential ingredient for fish aquaculture .

Abstract

Ulva lactuca is an opportunistic green seaweed (Chlorophyta) with high growth rates being found in marine and estuarine environments. This is one of the most studied seaweed and it has revealed to be suited for numerous commercial applications. One of the potential and more recent applications is the incorporation in the feed sector for fish aquaculture. Seaweeds are presented as an alternative source for several ingredients used in feed formulations that are becoming increasingly unsustainable, namely fishmeal and fish oil. Unlike fish, seaweeds are capable of synthetizing polyunsaturated fatty acids (PUFA), including omega 3 fatty acids (n-3) that are essential to fish and, therefore, need to be provided through their diet in order to ensure a healthy development. Despite having a low lipid content, Ulva lactuca, reveals an interesting qualitative lipid profile, having a high PUFA concentration, particularly n 3, when compared to saturated fatty acids (SFA) and monosaturated fatty acids (MUFA). This seaweed has a well-studied nutritional profile but its lipid synthesis and metabolism are still undeveloped topics. Deuterium (2H) is a stable isotope of hydrogen (1H) that can be delivered as a tracer, by incorporation in seaweed tank water, as deuterated water (2H2O). The tracer incorporates into lipid metabolism allowing the determination of the lipid flux through 1H/2H nuclear magnetic resonance (NMR). This technique has been successfully demonstrated in mice and fish to determine de novo lipogenesis (DNL), elongation and desaturation rates. In the present study different protocols were tested for pretreatment of the samples (oven drying and lyophilization), lipid extraction (Folch, MTBE, Direct Transesterification) and lipid purification (solid phase extraction with silica columns and solid phase extraction with sodium carbonate). Regarding lipid pretreatment, oven drying and lyophilization were both suited for lipid analysis, not revealing differences between the two treatments. The extraction method that provided the best results for NMR analysis was Direct Transesterification (DT) of fatty acids, revealing a more uniform lipid resonance, with less interference and overlapping signals when compared to Folch and MTBE. Moreover, with DT protocol lipid purification was unnecessary. Ulva lactuca discs growth could be determined either by area or weight. A correlation between the two parameters was established (y = 114.52x1.0068). Nevertheless, weight measurement was preferred for practical reasons. Tree distinct trials were made, in which Ulva lactuca discs were exposed to 2H2O for 6 days, dried and lipids were extracted. The lipidic content and lipid metabolic fluxes were determined by 1H/2H NMR. It was proved for the first time that seaweeds could incorporate 2H in their metabolism and that lipid metabolic fluxes, such as n-3 DNL, could be studied through 1H/2H NMR. The highest values of n-3 FA were observed in seaweeds grown at a normal rate of 7.90 ± 1.26% day-1, which presented a content of 63.68 ± 1.61% of PUFA, of which 30.45 ± 2.58% were n-3 FA, while MUFA and SFA were estimated to be 19.34 ± 4.00% and 16.98 ± 5.61%, respectively. These seaweeds synthetized n-3 FA de novo at a 2.82 ± 0.45% day-1 rate. Differences in lipid metabolism between seaweeds cultivated with nutrient supplemented medium (+N) and nutrient depleted medium (-N) were tested and PUFA content revealed to be significantly higher, by 6.1%, in +N conditions. The effect of two different culture temperatures (18 oC and 23 oC) in Ulva lactuca lipid metabolism was tested and differences were observed between the two treatments. Comparing to higher temperature, discs cultured at lower temperatures revealed an increase in unsaturation, reflected by a decrease of 5.71% in SFA, 6.54% in MUFA and consequently non n-3 FA, which decreased 9.14%, followed by increase of 12.24% PUFA and consequently n-3 FA, that increased by 9.14%. Overall, these results showed that lipid metabolism of Ulva lactuca can be further explored through 1H/2H NMR following the optimizations made to the analysis. As a partial alternative to fishmeal this seaweed seems to be a good source of n-3 FA (30.45 ± 2.58% of total FA) suited for fish feed supplementation, being synthetized de novo at a 2.82 ± 0.45% day-1 rate.

Ulva lactuca é uma macroalga verde (Chlorophyta) oportunista que apresenta elevadas taxas de crescimento podendo ser encontrada em ambientes marinhos e estuarinos. Esta é uma das algas mais estudadas e tem demonstrado aplicação em diversas utilizações comerciais. Uma das potenciais utilizações mais recentemente estudadas é a sua incorporação no sector das rações para aquacultura de peixes. As macroalgas podem ser utilizadas como fonte alternativa a vários ingredientes aplicados na formulação das rações cuja utilização se tem tornado cada vez mais, não sustentável, nomeadamente a farinha e óleo de peixe. Ao contrário dos peixes, as algas têm a capacidade de sintetizar ácidos gordos polinsaturados (PUFA), incluindo ácidos gordos ómega 3 (n-3), que são essenciais para os peixes e por isso necessitam de ser incluídos na sua dieta de modo a garantir um desenvolvimento saudável. Apesar de ter um baixo conteúdo total de lípidos, Ulva lactuca apresenta um perfil lipídico qualitativo interessante, apresentando altas concentrações de PUFA, particularmente n-3, comparando com o conteúdo apresentado em ácidos gordos saturados (SFA) e monoinsaturados (MUFA). O perfil nutricional desta alga tem sido extensamente estudado, contudo a informação sobre o seu metabolismo e síntese lipídica é escassa. O deutério (2H) é um isótopo estável de hidrogénio (1H), que pode ser incorporado como um marcador na água do tanque das macroalgas, sob a forma de água deuterada (2H2O). Este marcador é incorporado no metabolismo lipídico permitindo deste modo o cálculo do fluxo lipídico através de ressonância magnética nuclear (RMN) 1H/2H. Esta técnica foi utilizada com sucesso em ratos e peixes para determinar as taxas de lipogénese de novo (DNL), elongamento e desaturação dos ácidos gordos. Nesta dissertação foram testados diferentes protocolos de preparação das amostras (desidratação em estufa e liofilização), extração lipídica (Folch, MTBE e Transesterificação Direta) e de purificação lipídica (extração em fase sólida com colunas de sílica e extração em fase sólida com carbonato de sódio). Tendo em conta a preparação da amostra, a desidratação em estufa e a liofilização revelaram ser igualmente adequadas para a análise lipídica, não apresentando diferenças entre os dois tratamentos. O método de extração que apresentou os melhores resultados para análise foi a Transesterificação Direta dos ácidos gordos que revelou um espectro com ressonâncias mais uniforme, com menos interferências e menos sobreposição de sinais, quando comparado com Folch e MTBE. Utilizando o protocolo de Transesterificação Direta a purificação lipídica foi desnecessária. O crescimento dos discos de Ulva lactuca pode ser determinado através da medição da área ou do peso. Foi estabelecida uma correlação entre os dois parâmetros, explicada pela seguinte equação, y = 114.52x1.0068. Contudo, a pesagem foi preferida por ser mais prática. Foram realizados três testes distintos, em que discos cortados de lâminas de Ulva lactuca foram expostos a 2H2O durante 6 dias, sendo posteriormente desidratados e a fração lipídica extraída. O conteúdo em espécies lipídicas e os fluxos metabólicos lipídicos foram determinados por 1H/2H NMR. Foi provado, pela primeira vez, que as macroalgas conseguem incorporar 2H no seu metabolismo lipídico e que os fluxos lipídicos, como a DNL de n-3, podem ser determinados por 1H/2H RMN. Os valores mais elevados de n-3 foram observados em macroalgas que apresentaram um crescimento de 7.90 ± 1.26% por dia, revelando um conteúdo de 63.68 ± 1.61% de PUFA, dos quais 30.45 ± 2.58% eram n-3, enquanto que os MUFA e SFA apresentaram conteúdos de 19.34 ± 4.00% e 16.98 ± 5.61%, respetivamente. Foram também testadas as diferenças no metabolismo lipídico em macroalgas, geradas pelo cultivo em meio enriquecido com nutrientes (+N) e em meio de cultivo sem nutrientes (-N) e o conteúdo de PUFA revelou ser significativamente maior (6.1%) em condições de cultivo +N. Foi estudado o efeito do cultivo desta alga a diferentes temperaturas (18 oC e 23 oC) no metabolismo lipídico, sendo observadas diferenças entre macroalgas sujeitas a diferentes tratamentos. Comparando, com a diminuição da temperatura de cultivo foi observado um aumento de insaturação, refletido por uma redução de 5.71% em SFA, 6.54% em MUFA e consequentemente em ácidos gordos não n-3 de 9.14%, seguido por um aumento de 12.24% de PUFA e em particular n-3, que aumentaram 9.14%. Em suma, estes resultados revelaram que o metabolismo lipídico de Ulva lactuca pode ser estudado por 1H/2H RMN seguindo as otimizações realizadas para análise. Considerando esta macroalga como alternativa parcial à farinha de peixe, esta aparenta ser uma boa fonte de n-3 (30.45 ± 2.58% de ácidos gordos totais) adequada para suplemento de rações, sendo sintetizado de novo a uma taxa de 2.82 ± 0.45% por dia.