Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/33763
Title: Cryopreservation of germplasm of tamarillo ( Solanum bataceum Cav.)
Authors: Graça, Diana dos Santos Simões 
Orientador: Correia, Sandra
Canhoto, Jorge
Keywords: Embriões somáticos; Espécies lenhosas; Massas embriogénicas; Meristemas; Vitrificação
Issue Date: 2016
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A preservação de germoplasma é extremamente importante nos atuais programas de melhoramento genético e de conservação. Devido às alterações genéticas que o melhoramento de plantas pode impor e às taxas de extinção de numerosas plantas, é crucial armazenar recursos genéticos a fim de minimizar a perda de biodiversidade. Os métodos de conservação in vitro dependem da duração de armazenamento pretendida e para armazenamento a longo prazo, a criopreservação é o único método atualmente disponível. Os métodos de criopreservação, slow cooling e vitirificação, foram testados em tecidos embriogénicos de tamarilho (Solanum betaceum Cav.) e a vitrificação mostrou ser o método mais eficaz a aplicar nesta espécie. O tamarilho é uma árvore da família das solanáceas proveniente da região andina e economicamente importante devido ao alto teor nutritivo dos seus frutos. Uma das ferramentas biotecnológicas mais importantes que podem ser aplicadas a esta espécie é a embriogénese somática (SE), cujo protocolo foi elaborado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade de Coimbra. A indução de embriões somáticos nesta espécie pode ser alcançada através de um processo “two-step". Neste procedimento embriões zigóticos e segmentos foliares são primeiramente expostos a um meio MS com auxina e concentrações elevadas de sacarose formando massas embriogénicas e não embriogénicas (que podem ser subcultivadas). As massas embriogénicas são depois transferidas para um meio isento de auxina para permitir o desenvolvimento de embriões somáticos. No entanto, a manutenção dos calos requer subculturas frequentes o que consome muito espaço e torna o processo trabalhoso. Além disso, quando em cultura a longo prazo ocorrem alterações do cariótipo e outros eventos que causam variação somaclonal, resultando em embriões atípicos. Neste trabalho, quatro linhas diferentes de massas embriogénicas foram submetidas a uma etapa de 5 dias de habituação (4 °C no escuro) e uma pré-cultura de 3 dias em meio MS (Murashige e Skoog) sem hormonas e com um aumento progressivo na concentração de sacarose: 0,25 M, 0,5 M a 1 M (24 h cada, 4 °C, no escuro). No método de arrefecimento lento (slow cooling), os tecidos foram tratados com a solução crioprotetora de DMSO (60 e 90 min) e lentamente congelados até a uma temperatura intermédia de -40 °C, de forma a promover a vitrificação do citoplasma, após imersão em azoto líquido (LN). Na vitrificação para osmo-protecção, à temperatura ambiente (RT), foi adicionada uma solução de carregamento (loading solution; 30 min). Posteriormente essa solução foi substituída pela solução Plant Vitrification Solution 2 (PVS2) durante 60 min. a 0 ºC, tempo após o qual a solução PVS2 foi renovada e as massas embriogénicas foram imersas em azoto líquido. Depois da descongelação rápida num banho a 40 °C, os calos foram então transferidos para o mesmo meio de indução (MS suplementado com 5 mg L-1 picloram ou 2 mg L-1 ácido diclorofenoxiacético, 90 g L-1 sacarose e 2,5 g L-1 de Phytagel). Para a vitrificação, antes de colocar os tecidos em condições de recuperação, a solução PVS2 foi substituída com uma solução de lavagem (Washing solution; 30 min RT). A quantificação foi executada através da monitorização do peso das amostras durante quatro meses, em intervalos regulares de um mês. A quantificação dos tecidos foi realizada durante a sua fase de crescimento exponencial, consequentemente, a taxa de crescimento dos calos foi calculada utilizando uma regressão exponencial de massa/tempo. A taxa de crescimento média dos calos criopreservados atingiu cerca de 0,5 g/mês para três linhas (50% menos do que o controlo normal). Também foi observada uma diminuição de 50% de plantas germinadas para calos criopreservados quando em comparação com o controlo normal. Os mesmos procedimentos foram aplicados a embriões somáticos e meristemas de tamarilho. No entanto, resultados conclusivos só poderão ser obtidos posteriormente ao período de defesa desta tese. Os resultados obtidos até agora mostraram que a criopreservação por vitrificação com PVS2 é um método viável para manter massas embriogénicas de tamarilho uma vez que foi eficaz para três das quatro linhas testadas.
Germplasm preservation has a very important role in current breeding and conservation programs. Due to either the genetic alterations that plant breeding may impose and to the extinction rate numerous plants are facing, it is crucial to store genetic resources to minimize biodiversity losses. The success of in vitro conservation depends on the storage duration. For long-term storage, cryopreservation is the only method available. Slow cooling and vitrification procedures were tested on tamarillo’s (Solanum betaceum Cav.) embryogenic tissues and vitrification was found to be an adequate method to apply to this species. Tamarillo is a solanaceous tree from the Andean region and economically important due to its fruits high nutrient content. One of the most important biotechnological tools that can be applied to this species is somatic embryogenesis (SE), which protocol was elaborated at the Laboratory of Plant Biotechnology of the University of Coimbra. Induction of somatic embryos on this species can be achieved through a “two-step” process. In this procedure zygotic embryos and leaf segments are first exposed to MS (Murashige and Skoog) medium with an auxin and high concentrations of sucrose forming embryogenic and non embryogenic masses (that can be subcultured). Embryogenic masses are then transferred to an auxin-free medium to allow somatic embryos development. However, maintenance of the calli requires frequent subcultures making the process labour-intensive and space consuming. Furthermore, in long-term cultures, karyotype aberrations and other events causing somaclonal variation occur resulting in atypical embryos. Four different lines of embryogenic masses were submitted to a 5-day cold hardening stage (4 ºC in the dark) and a 3-day preculture on a hormone-free MS medium with an increasing sucrose concentration of 0.25 M, 0.5 M and 1 M, 24 h each (4 °C in the dark). For slow cooling the tissues were treated with cryoprotectant DMSO solution (60 and 90 min) and slowly cooled to an intermediate temperature of -40 °C, promoting the cytoplasm vitrification, upon a subsequent immersion in liquid nitrogen (LN). In vitrification, a loading solution was added (30 min) at room temperature (RT) for osmo-protection. The loading solution was then removed and changed by plant vitrification solution 2 (PVS2) for 60 min. at 0 ºC, time after which the PVS2 solution was renewed and the embryogenic masses immersed in liquid nitrogen. Following rapid thawing in a water bath at 40 °C the calli were then transferred to the same induction medium (MS supplemented with 5 mg L-1 picloram or 2 mg L-1 2.4-dichlorophenoxyacetic acid, 90 g L-1 sucrose and 2.5 g L-1 Phytagel). For vitrification, before placing the tissues in recovery conditions, the PVS2 solution was replaced with a washing solution (30 min at RT). The quantification was carried out by monitoring the samples weight during four months at regular intervals of one month. The quantification of the tissues was performed during the exponential growth stage, therefore, the calli’s growth rate was calculated using an exponential regression of mass over time. The average growth rate of cryopreserved calli reached about 0.5 g/month for three lines (50 % less than normal control). As for germinated plants, a 50 % decrease was observed for cryopreserved calli when compared to the normal control. The same procedures were applied to tamarillo’s somatic embryos and meristematic cells. However, the time to get trustable results goes over the time-lapse for the presentation of this thesis. More time will be needed to obtain firm conclusions. The results so far obtained have shown that cryopreservation by PVS2 vitrification is a viable method to maintain embryogenic masses of tamarillo for it was effective for three of the four lines tested.
Description: GRAÇA, Diana dos Santos Simões - Cryopreservation of germplasm of tamarillo ( Solanum bataceum Cav.). Coimbra : [s.n.], 2016. Dissertação de Mestrado.
URI: http://hdl.handle.net/10316/33763
Rights: embargoedAccess
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