Mitochondria-directed antioxidants as anticancer agents

Abstract

O cancro é uma das doenças mais disseminada e fatal das últimas décadas. Devido ao seu carácter multifatorial, esta doença tem sido extremamente difícil de controlar. Os fármacos existentes para o tratamento desta doença são extremamente tóxicos para o tecido saudável, uma vez que possuem mecanismos de ação muito pouco específicos, podendo interagir tanto com células tumorais como com células saudáveis. Para além disso, as células tumorais podem desenvolver resistência aos fármacos usados na quimioterapia. Por esse motivo, a investigação clínica tem vindo a aumentar no sentido de desenvolver um fármaco, algo que podemos denominar como a “bala mágica”, que seria capaz de se ligar especificamente a um potencial alvo terapêutico. Os compostos usados neste trabalho foram desenvolvidos de modo a ter a mitocôndria como alvo, dada a importância desta para o funcionamento normal de células eucarióticas. A mitocôndria é um organelo importante para a homeostasia celular pois controla a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Relativamente a este a processo, a fuga de eletrões através dos complexos I e III pode levar à formação de espécies reativas de oxigénio (ERO), como é o caso do anião superóxido. Geralmente, as células tumorais produzem mais ERO do que as células saudáveis, o que justifica a consideração desta como um potencial alvo para o tratamento de cancros. Com esse propósito em mente, foram desenvolvidos na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, dois compostos derivados do ácido cafeico e da vitamina K, MitoXT1 e MitoXT2, respetivamente. Estes compostos possuem um grupo tetrafenifosfónio capaz de aumentar o redireccionamento destes compostos para o interior da mitocôndria, tendo-se demonstrado em ensaios preliminares que possuem atividade antioxidante. O presente trabalho tem dois objetivo principais: a) investigar se os compostos MitoXT1 ou MitoXT2 irão aumentar a citotoxicidade de anticancerígenos clássicos como doxorrubicina (DOX), cisplatina (CIS) e etoposídeo em células do cancro do pulmão A549 e b) investigar se os mesmos compostos irão proteger os fibroblastos do pulmão MRC-5 dos efeitos tóxicos dos efeitos tóxicos dos anticancerígenos mencionados acima. O estudo foi realizado com um pré-tratamento de 24h com os antioxidantes seguido de uma incubação de 24 ou 48h com as correspondentes drogas. A viabilidade celular, a atividade de caspases, a produção de superóxido e o ciclo celular foram avaliados de modo a tirar conclusões sobre o efeito destes antioxidantes dirigidos para a mitocôndria nas duas linhas celulares em estudo na presença ou ausência dos agentes anticancerígenos. Os resultados obtidos sugerem que o composto MitoXT2 protege as células MRC-5 da morte celular resultante de toxicidade de DOX enquanto, em células A549, causa citotoxicidade quando combinado com esse agente anticancerígeno. A conjugação do mesmo antioxidante com CIS aumentou significativamente a toxicidade contra as células A549 enquanto em células MRC-5 mostra pouca ou nenhuma toxicidade. Curiosamente, MitoXT2 diminui pouco mas significativamente a toxicidade induzida por DOX em cardiomioblastos H9c2. Quanto aos efeitos de MitoXT1, são menores do que MitoXT2 com nenhum aumento na citotoxicidade resultando do tratamento conjunto de MitoXT1 com etoposídeo e CIS. Ao medir as atividades das caspases 3 e 9, verifica-se que MitoXT2 aumenta a atividade da caspase 3 quando adicionado antes de DOX mas, interessantemente, decresce a mesma atividade em células MRC-5, sugerindo novamente alguma proteção para a linha celular não tumoral. Surpreendentemente, a combinação de MitoXT1 com CIS aumentou a atividade das caspases 3 e 9, na linha celular tumoral, enquanto diminui essa atividade na linha celular não tumoral. O ensaio de Live/Dead realizado por citometria de fluxo, embora menos robusto em termos de diferenças, mostra um pequeno aumento aparente na quantidade de células mortas quando o antioxidante foi usado em combinação nas células tumorais, verificando-se o oposto nas células não tumorais. Utilizando sondas vitais nucleares e mitocondriais, verificou-se por microscopia de epifluorescência uma despolarização mitocondrial e condensação da cromatina, estando estes dois processos associados à citotoxicidade apresentado pelas moléculas de diferença, sozinhas ou em combinação. Em relação à análise dos dados obtidos para o ensaio do ciclo celular, estes parecem depender do tipo de célula e do tipo de composto mas o reduzido número de experiências não permitiu tirar nenhuma conclusão. Finalmente, os resultados obtidos usando a sonda MitoSOX específica para o anião superóxido mitocondrial sugerem que a combinação de agentes pode contribuir na produção de espécies reativas de oxigénio. Em conclusão, embora preliminar, o presente trabalho demonstra que novas moléculas dirigidas à mitocôndria podem ser usadas para aumentar a citotoxicidade de agentes anticancerígenos, tal como foi verificado no modelo de células do cancro de pulmão. Curiosamente, algumas das avaliações dos dados obtidos pela mesma abordagem resultaram numa menor toxicidade para as células não tumorais. Além disso, o presente trabalho demonstra a existência de uma característica até então desconhecida das duas novas moléculas; a sua capacidade para aumentar a sua produção de anião superóxido mitocondrial, o que pode contribuir para um efeito do tipo hormese. Mais trabalho deve ser realizado de modo a identificar os mecanismos envolvidos nestas e noutras linhas celulares tumorais.

Cancer is one of the most widespread and fatal diseases of the past decades. Due to its multifactorial character, this disease has been extremely difficult to control. Current drugs used in chemotherapy are extremely toxic to healthy tissue since they have poor specific mechanisms of action, leading to unspecific action in healthy tissues. In addition, the lack of efficacy of these compounds may be due to acquired or intrinsic resistance. Therefore, clinical research has been increasing in order to develop a drug, which may be termed as the "magic bullet", more specific to a potential therapeutic target. The compounds used in this study were developed to be directed to the mitochondria, given the importance of this organelle for the normal functioning of eukaryotic cells. Mitochondria are important organelles for cell homeostasis as they control the production of ATP by oxidative phosphorylation. For this process, the escape of electrons through complexes I and III can lead to the formation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion. Generally speaking, cancer cells produce more ROS than healthy cells, which justifies considering mitochondria as potential targets for treating cancers. With this purpose in mind, two molecules derived from caffeic acid and vitamin K, MitoXT1 and MitoXT2 respectively, were developed at the Faculty of Science, University of Porto. These compounds have a tetraphenyl phosphonium group that increases the targeting of these compounds into mitochondria and demonstrated antioxidant activity in a series of preliminary experiments. The present work has two tandem objectives: a) investigate whether MitoXT1 or MitoXT2 increase the cytotoxicity of classic anti-cancer agents, doxorubicin (DOX), cisplatin (CIS) and etoposide, on human lung cancer A549 cells and b) investigate whether the same agents protect lung MRC-5 fibroblasts from the toxicity of the above mentioned anti-cancer agents. The study was performed with a pre-treatment with antioxidants for 24h followed by incubation for 24 or 48 h with corresponding anti-cancer agent. Cell viability, caspase activity, superoxide production and cell cycle were assessed in order to investigate the effect of these mitochondria-directed antioxidants in both cell lines studied in the presence and absence of the anti-cancer agents. The results obtain suggest that the compound MitoXT2 protect MRC-5 cells from cell death resulting from DOX toxicity, while still causing cytotoxicity to A549 cells in conjugation with that snit-cancer agent. The conjugation of the same antioxidant with CIS also resulted in significant toxicity against A549 cells while showing little, if any toxicity against MRC-5 cells. Interestingly, MitoXT2 slightly, but significantly, decreased DOX toxicity on H9c2 cardiomyoblast. Regarding MitoXT1, the effects were somehow lower than MitoXT2 with no increased cytotoxicity resulting from MitoXT1 in conjugation with etoposide and CIS. When measuring caspase-like activities (caspase 3 and 9) MitoXT2 increase caspase 3 activity when added before DOX to A549 cells but interestingly decrease that same activity in MRC5 cells, again suggesting some protection to the non-tumour cell line. Surprisingly, the combination of MitoXT1 with CIS increased caspase 3 and 9-like activities in the tumour cell line, while decreasing those specific activities in the non-tumour cell line. Live/Dead assays by flow cytometry, although less robust in terms of differences, shows an apparent small increase in dead cells when the antioxidant were used in combination in tumour cells and the inverse in non-tumour-cells. Vital epifluorescence microscopy using nuclear and mitochondrial dyes appear to show that mitochondrial depolarization and chromatin condensation are associated to the cytotoxicity presented by the difference molecules, alone or in conjugation. Data was also obtained regarding cell cycle analysis which appear to be compound and cell type-dependent but the reduced number of experiments does not allow any conclusions. Finally, results obtained by using the mitochondrial superoxide anion specific dye MitoSOX suggest that the combination of agents may contribute to increase the production of the reactive oxygen species. In conclusion, although preliminary, the present work demonstrates that the novel mitochondria-directed molecule may be used to increase the cytotoxicity of anti-cancer agents as seen in a cell model for lung cancer. Interestingly, some of the data obtained suggested that the same approach resulted in a lower toxicity for non-tumour cells. Furthermore, the present work highlights a previously unknown feature of the two novel molecules: their ability to increase mitochondrial superoxide anion production, which can contribute to a hormesis-type effect. More work must be performed to distinguish the mechanisms involved and whether these are extended to others cancer cell lines.