Modulation of induced pluripotency by substrate rigidity

Abstract

As células estaminais mesenquimais (MSCs) são células estaminais adultas, multipotentes, capazes de se auto renovar e diferenciar em diferentes tipos celulares dentro das linhagens de origem mesenquimal. A colheita de células estaminais mesenquimais é feita a partir de tecidos mesenquimais e também de tecidos extra embrionários. Estes últimos constituem uma boa fonte de MSCs, sendo estas mais naïve e com maior potencial de proliferação do que MSCs de tecidos adultos, características que fazem com que MSCs da matriz do cordão umbilical sejam um tipo celular muito apelativo para experiências de reprogramação. A geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs), nomeadamente a partir de MSCs, tem sido documentada na literatura por diferentes autores, no entanto sempre associada a uma baixa eficiência. É sabido que células estaminais pluripotentes e os seus núcleos têm propriedades elásticas distintas daquelas apresentadas por células diferenciadas e células estaminais adultas (e os seus respectivos núcleos). A partir destas observações colocámos a hipótese de que, através da modulação da rigidez de MSCs, poderíamos aumentar a eficiência do processo de reprogramação usando um vector lentiviral que codifica factores de pluripotência. O núcleo está mecanicamente acoplado a elementos do citoesqueleto através do complexo LINC (ligante do nucleoesqueleto ao citoesqueleto) e desta forma as forças mecânicas vindas da matriz extracelular podem ser transmitidas através do citoesqueleto até ao núcleo. Dependendo da rigidez do substrato, o núcleo está sob maior ou menor tensão, sendo eventualmente possível modular o seu módulo elástico se as células forem plaqueadas em plataformas com diferentes graus de rigidez. Com este trabalho demonstrámos que ao plaquear MSCs em substratos com distintos graus de rigidez, é possível torná-las mais propícias a uma total reprogramação. Para além disto, verificou-se também um aumento na expressão de genes de pluripotência devido apenas ao facto de MSCs serem mantidas em cultura em substratos específicos. Ao analisarmos o estado de compactação da cromatina, bem como a área nuclear tornou-se evidente o efeito que a rigidez dos substratos tem sobre as células. Assim sendo, os rácios do conteúdo eucromático e heterocromático dos núcleos, bem como a área nuclear mostraram ser modulados, o que sugere que os núcleos sofrem mecanomodulação. Foram também observadas diferenças no que ao tamanho das Adesões focais (FAs) e à organização das fibras de actina diz respeito. Tomando em conjunto todos os nossos resultados, verificou-se que é possível melhorar o processo de reprogramação através da modulação da rigidez do substrato, e que o mecanismo por detrás desta melhoria pode estar intimamente relacionado com a mecanomodulação do núcleo. Este progresso na geração de iPSCs humanas, recorrendo a substratos de rigidez definida, dá indícios de que os protocolos habituais de reprogramação celular em plataformas convencionais de cultura de células podem ser substancialmente melhorados plaqueando as células nesses mesmos substratos. Deste modo, aumentado a eficiência e a cinética da geração de células estaminais pluripotentes induzdas, estudos futuros poderão explorar a utilização de vectores de reprogramação não integrativos, considerados mais seguros para possíveis aplicações clínicas.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult stem cells able to self-renew and differentiate into several cell types within mesenchymal origin, which can be collected from adult mesenchymal tissues, and also from extra-embryonic tissues. The latter constitute a good source of MSCs, being more naïve and having a more proliferative potential than MSCs from adult tissues, features that make umbilical cord matrix MSCs an appealing cell type for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The generation of human iPSCs, namely from human MSCs, has been reported, although with a low efficiency. It is known that pluripotent stem cells and their nuclei possess distinct elastic properties from differentiated and adult stem cells (and respective nuclei). We hypothesize that, by modulating the rigidity of MSCs, it may be possible to enhance the reprogramming efficiency using a lentiviral vector encoding pluripotency factors. The nucleus is mechanically coupled to cytoskeletal elements by the LINC (Linker of Nucleoskeleton to Cytoskeleton) complex, thus mechanical forces from the extracellular matrix can be transmitted through the cytoskeleton to the nucleus. Depending on substrate stiffness, the nucleus is under more or less tension, eventually being possible to modulate its rigidity by culturing the cells on platforms with distinct degrees of stiffness. Here we demonstrated that MSCs plated on substrates with distinct range of rigidity showed different degrees of efficiency to fully reprogram. Moreover, it was shown that maintaining MSCs on specific substrates enhanced the expression of pluripotency genes. The effect of substrate rigidity on the cells was evident when chromatin compaction and nuclear area were analyzed. Thus, nuclear euchromatic and heterochromatic content ratios and area could be modulated, suggesting that nuclei were subjected to mechanomodulation. Differences were also observed in what concerns the size of Focal adhesions (FAs) and the assembling of actin stress fibers. Taken together, our results suggest that it is possible to improve the reprogramming process by modulating the substrate rigidity, and that the mechanism responsible for this improvement could be intimately related with the mechanomodulation of the nuclei. The enhanced generation of human iPSCs cells using substrates with defined stiffness indicates that the current cell reprogramming protocols can be substantially improved by seeding the cells on such substrates. Thus, by improving the efficiency and kinetics of iPSCs generation, future strategies may be further explored using non integrative reprograming delivery strategies, considered safer for putative future clinical applications.