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Title: Betacellulin and Neurogenesis in the Adult Central Nervous System
Authors: Santos, Inês da Costa 
Orientador: Lovell-Badge, Robin
Duarte, Carlos
Keywords: Neurogénese adulta; ZSV; Betacelulina; SeeDB; Clarity; CRISPR/CAS 9
Issue Date: 2015
Citation: SANTOS, Inês da Costa Santos - Betacellulin and neurogenesis in the adult central nervous system. Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Neural  stem  cells  (NSCs)  reside  in  special  niches  in  the  adult  brain,  including   subventricular  zone  (SVZ)  of  the  lateral  ventricle  and  subgranular  zone  (SGZ)  of  the   dentate  gyrus.  Blood  vessels  are  an  important  coumpound  of  the  neurogenic  niches  as   they  secreate  proteins  such  as  betacellulin  (BTC)  that  stimulate  NSC  proliferation,  self-­‐ renewal  and  differentiation.  BTC  is  a  member  of  the  epidermal  growth  factor  (EGF)  family   of  ligands,  and  has  been  widely  studied  in  many  different  contexts.  Recently,  it  has  been   demonstrated  that,  in  vitro,  BTC  can  induce  NSC  proliferation,  promote  self-­‐renewal  and   prevent  spontaneous  differentiation.  In  vivo,  BTC  can  also  promote  neurogenesis.  BTC  is   released  into  the  neurogenic  niche  by  endothelial  cells  of  the  microvasculature  and  by  the   choroid  plexus  (CP).  It  is  thought  that  BTC  activity  in  NSCs  is  mediated  through  ErbB1  and   ErbB4  receptors  whose  activation  stimulate  the  AKT  and  MEK  signalling  pathways.     In  my  thesis  I  carried  out  analysis  understanding  the  influence  of  BTC  and  other   growth  factors  on  NSCs  in  vitro  using  the  neurosphere  assay  and  measuring  neurospheres   number  and  size.  I  also  studied  the  importance  of  AKT  and  MEK  signalling  pathways  in   NSCs  cultivated  in  medium  supplemented  with  different  growth  factors  including  BTC.  I   observed  an  increase  in  cell  cycle  arrest  when  inhibitors  of  both  signalling  pathways  were   added  together  in  all  culture  conditions.  Studies  to  better  characterize  the  interaction   between  neurogenic  niche  and  BTC  were  also  carried  out  using  newly  developed   visualisation  techniques,  SeeDB  and  CLARITY  that  allowed  us  to  have  a  3D  perspective.  In   parallel,  I  made  BTC  conditional  and  BTC  reporter  contructs  for  generating  mice  using   newly  developed  CRISPR/  Cas  9  technique.  These  mice  will  allow  us  to  better  understand parallel,  I  made  BTC  conditional  and  BTC  reporter  contructs  for  generating  mice  using   newly  developed  CRISPR/  Cas  9  technique.  These  mice  will  allow  us  to  better  understand  the relative importance of BTC in adult NSCs and whether BTC transcription is modulated  
  As  células  estaminais  neuronais  estão  localizadas  em  nichos  celulares   especializados  no  cérebro  adulto,  incluindo  a  zona  subventricular  (ZSV)  no  ventrículo   lateral  e  a  zona  subgranular  (ZSG)  no  giro  denteado.  Os  vasos  sanguíneos  são  um   componente  importante  dos  nichos  neurogenicos  pois  eles  secretam  proteínas  como  é  o   caso  da  betacelulina  (BTC)  que  estimula  a  proliferação,  auto-­‐renovação,  e  diferenciação   das  células  estaminais  neuronais.  A  BTC  é  um  membro  da  família  de  ligandos  do  factor  de   crescimento  epidermal,  e  tem  sido  amplamente  estudada  em  muitos  contextos  diferentes.   Recentemente,  foi  demonstrado  que,  a  BTC  induz  a  proliferação,  promove  a  auto-­‐ renovação  e  previne  a  diferenciação  espontânea  das  células  estaminais  neuronais,  in  vitro.   In  vivo,  a  BTC  também  promove  a  neurogénese.  A  BTC  é  libertada  no  nicho  neurogénico   pelas  células  endoteliais  da  microvasculatura  e  pelo  plexo  coróide.    Pensa-­‐se  que  a   atividade  da  BTC  nas  células  estaminais  neuronais  é  mediada  pelos  receptores  ErbB1  e   ErbB4,  cuja  ativação  estimula  as  vias  de  sinalização  AKT  e  MEK.   Na  minha  tese,  procedi  a  análises  por  forma  a  perceber  a  influência  da  BTC  e   outros  factores  de  crescimento  nas  células  estaminais  neuronais,  in  vitro,  usando  para  isso   o  ensaio  de  neuroesferas  bem  como  medindo  o  diâmetro  e  contando  o  número  de   neuroesferas.  Também  estudei  a  importância  das  vias  de  sinalização  AKT  e  MEK  nas   células  estaminais  neuronais  postas  em  cultura  em  meio  suplementado  com  diferentes   factores  de  crescimento  incluindo  a  BTC.  Em  todas  as  condições  de  cultura,  eu  observei  um   aumento  da  paragem  do  ciclo  celular  quando  foram  adicionados  os  inibidores  de  ambas  as   vias  de  sinalização  em  conjunto.  Foram  também  levados  a  cabo  estudos  para  melhor   perceber  a  interação  entre  o  nicho  neurogénico  e  a  BTC  usando  para  isso  novas  técnicas  de   visualização  ,  como  é  o  caso  do  SeeDB  e  do  CLARITY  que  nos  permitiu  ter  uma  perspectiva   3D  dessa  mesma  interação.  Em  paralelo,  eu  criei  construções  para  gerar  ratos  condicionais   e  ratos  repórter,  usando  a  nova  técnica  CRISPR/Cas  9.  Estes  ratos  irão  permitir-­‐nos  melhor   perceber  a  importância  relativa  da  BTC  nas  células  estaminais adultas e também perceber onde a transcrição da BTC é modulada  
 
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/31230
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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