To beat or not to beat: detrimental autophagy contributes to gap junctions degradation in ischemic heart

Abstract

A contracção coordenada do músculo cardíaco depende em larga medida de uma eficiente comunicação intercelular entre os cardiomiócitos. Esta comunicação é maioritariamente mediada por gap junctions (GJ), que são canais transmembranares formados por seis subunidades de uma proteína denominada conexina (Cx), e que permitem uma rápida e anisotópica propagação do impulso eléctrico. Assim, uma correcta e eficiente comunicação entre os cardiomiócitos é vital para assegurar o normal funcionamento do coração. Desta forma, mecanismos que afectem o ciclo de vida da Cx43, a principal Cx presente nas GJ do ventrículo esquerdo, e consequentemente afectem a comunicação intercelular podem ter implicações muito profundas na função cardíaca. Efectivamente, várias cardiomiopatias têm sido associadas a distúrbios na comunicação intercelular mediada por GJ, os quais têm sido parcialmente atribuídos a um aumento da degradação da Cx43. Apesar da sua importância, os mecanismos moleculares associados à degradação da Cx43, nomeadamente no coração em isquémia, permanecem por esclarecer. Resultados recentes do nosso grupo demostraram que a Cx43 é um substrato da autofagia, uma via proteolítica que se sabe estar activada durante a isquémia. Com base nestes resultados, e uma vez que a sua relevância fisiopatológica permanece indeterminada, o principal objectivo do presente estudo é esclarecer o papel da autofagia na degradação da Cx43 induzida pela isquémia nos cardiomiócitos. Através do uso de linhas celulares de cardiomiócitos (HL-1) e culturas organotípicas de tecido cardíaco, demostrámos que a isquémia leva a uma degradação da Cx43 que pode ser parcialmente revertida pela inibição química e genética da via autofágica, nomeadamente através do silenciamento do p62. O envolvimento da autofagia foi confirmado também através de ensaios de co-localização e coimunoprecipitação, nos quais demonstrámos que a Cx43 interage com as proteínas da maquinaria da autofagia, nomeadamente com a LC3, p62 e NBR1. Adicionalmente, demonstrámos que a degradação da Cx43 na reperfusão é mais acentuada que em períodos equivalentes de isquémia e, mais importante, que a degradação da Cx43 em isquémia ou isquémia/reperfusão assenta em diferentes mediadores moleculares. Usando inibidores farmacológicos da AMPK ou o silenciamento da Beclina 1, os resultados obtidos mostram que durante os períodos iniciais de isquémia, a degradação da Cx43 é mediada maioritariamente pela AMPK, enquanto que durante períodos mais tardios de isquémia ou durante a reperfusão, a Beclina 1 é o principal mediador. Ao contrário do observado nas abordagens envolvendo linhas celulares ou culturas organotípicas, onde se observa uma degradação acentuada da Cx43 em isquémia, no modelo de Langendorff, apenas a reperfusão é capaz de induzir uma degradação robusta da proteína, enquanto a isquémia resulta numa ligeira degradação da Cx43 só nos períodos mais prolongados. Desta forma, os resultados presentes neste trabalho constituem novas provas relativamente aos mecanismos moleculares associados à degradação da Cx43 no coração em isquémia, o que poderá constituir uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de novas estratégias moleculares com vista à preservação da função cardíaca na isquémia

Gap junction intercellular communication (GJIC) between cardiomyocytes is essential for coordinated cardiac muscle contraction, which involves rapid anisotropic impulse propagation through connexin (Cx)-containing channels. Therefore, disturbing mechanisms that affect the turnover of Cx43, the main GJ protein present in the left ventricle, has profound effects on heart function. Accordingly, several cardiomyopathies have been related to dysfunctional GJIC, partially attributed to increased Cx43 degradation. Nevertheless, the molecular mechanisms underlying ischemia-induced degradation of Cx43 remain largely undefined. Therefore, the main objective of this study was to establish whether autophagy mediates degradation of Cx43 in cardiomyocytes subjected to ischemia. Using both HL-1 cells and organotypic heart slices we showed that ischemia-induced Cx43 degradation can be reverted by chemical and genetic inhibition of autophagy, namely through the silencing of p62. The involvement of autophagy was further confirmed by co-localization and co-immunoprecipitation assays in which we demonstrated that Cx43 interacts with proteins of the autophagy machinery, such as LC3, p62 and NBR1. Strikingly, we showed that degradation of Cx43 in ischemia or reperfusion relies upon different molecular players. Indeed, degradation of Cx43 during early periods of ischemia depends on AMPK, whereas in late periods of ischemia and in reperfusion it relies on Beclin 1. Contrarily to the observed in the cell line and in organotypic cultures, in the ex vivo model, the Langendorff heart, only reperfusion was able to induce a robust degradation of Cx43, while no-flow ischemia results in a slight degradation of the protein, only after prolonged times. Altogether, this data provides new evidence regarding the molecular mechanisms whereby Cx43 is degraded in the ischemic heart, which may contribute for the development of new strategies that aim to preserve cardiac function in ischemia.