Towards determining the importance of bone marrow-derived factors in supporting human B acute lymphoblastic leukaemia growth in vivo

Abstract

In the bone marrow (BM), stromal cells create special microenvironments or niches indispensable for the maintenance, proliferation and differentiation of haematopoietic stem cells (HSCs) and their derivatives, such as B cells. Moreover, evidence suggests that the BM microenvironment promotes malignant growth, including acute B lymphoblastic leukaemia (B-ALL). Currently, most of the knowledge on the interactions occurring in this malignant niche has been provided by in vitro systems and in vivo models unable to fully simulate the human BM. We set out to determine if C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) and interleukin 7 (IL-7), stroma-derived factors, play a crucial role in B-ALL growth using a novel mouse model with subcutaneously implanted ectopic human BM niches downregulated for these factors. In vitro preliminary results not only demonstrated the biological importance of BM mesenchymal stromal cells (MSCs) and of these factors on B-ALL, but also allowed the development of functional assays to test the genetically manipulated MSCs produced. As constitutive knock down (KD) of these factors led in most cases to loss of in vivo bone forming, we generated human inducible KD MSCs for VCAM-1, IL-7 and CXCL12, and validated successful KD of VCAM-1 and IL-7 at mRNA and/or protein levels. Furthermore, to test complete ablation of our targets, we developed human knock out (KO) MSCs for CXCL12, VCAM-1 and CD44 using the CRISPR/Cas system. A decrease at the protein level of CXCL12 and VCAM-1 was observed in KO MSCs, which seemed to result in the reduction of adhesion of B-ALL cells to VCAM-1 KO MSCs. Taken together, we generated tools that allow the in vivo confirmation of our in vitro data which indicates the importance of CXCL12, VCAM-1, IL-7 for B-ALL migration, adhesion and growth. Further understanding on the communication between B-ALL cells and the BM cellular niches will contribute to the improvement of current as well as to the development of novel therapies.

As células do estroma presentes na medula óssea (MO) formam microambientes ou nichos que são indispensáveis à manutenção, proliferação e diferenciação de células estaminais hematopoiéticas, assim como de células que se diferenciam a partir destas, como os linfócitos B. O microambiente da MO também favorece e promove o crescimento maligno de células cancerígenas, tal como de leucemia linfóide aguda de linfócitos B (LLA-B). A maioria das evidências experimentais atuais acerca das interações existentes neste nicho provêm de experiências in vitro e de modelos animais incapazes de simular totalmente a MO humana. O principal objetivo deste trabalho foi determinar se C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) and interleukin 7 (IL-7), fatores derivados do estroma da MO, desempenham um papel importante no crescimento de LLA-B, utilizando um novo modelo semelhante ao sistema humano. Este modelo consiste na implantação subcutânea em murganhos imunodeficientes de nichos de MO que expressam níveis reduzidos de CXCL12, VCAM 1 e IL-7. Resultados preliminares in vitro demonstraram a importância biológica das células mesenquimais do estroma (CME) da MO e dos fatores estudados em LLA-B, e permitiram desenvolver ensaios funcionais para testar o efeito de CME geneticamente manipuladas. Como a supressão (KD) permanente destes fatores levou à perda da capacidade de formar osso in vivo, gerámos CME cujos níveis de VCAM-1, IL-7 e CXCL12 podem ser suprimidos de uma forma controlada e validámos a supressão de VCAM-1 e IL-7 ao nível do mRNA e da proteína. Para testar o efeito da supressão total destes fatores, desenvolvemos CME deficientes em VCAM-1, CXCL12 e CD44 utilizando o sistema CRISPR/Cas. Foi observado um decréscimo na expressão de CXCL12 e VCAM-1 ao nível da proteína e, sob o ponto de vista funcional, a supressão dos níveis de VCAM-1 resultou na redução da adesão de células de LLA-B. Em resumo, neste trabalho desenvolvemos ferramentas que permitem a confirmação in vivo dos nossos resultados obtidos in vitro que sugerem a importância dos fatores estromais VCAM-1, IL-7 e CXCL12 para a migração, adesão e crescimento de LLA-B. Uma melhor compreensão da comunicação entre células de LLA-B e os nichos celulares da MO permitirá a melhoria das terapias atuais e ainda o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos.