Molecular and biochemical studies of a mycobacterial maltokinase and a unique octanoyltransferase: Towards reconstruction of the pathway for methylglucose lipopolysaccharides biosynthesis

Abstract

As micobactérias pertencem a um género bacteriano extremamente diverso que contém bactérias saprófitas e patogénicas. Das patogénicas destacam-se Mycobacterium leprae e Mycobacterium tuberculosis, os agentes etiológicos da lepra e da tuberculose, respectivamente. A tuberculose encontra-se entre as doenças com maior taxa de mortalidade causadas por um único agente infeccioso e a sua erradicação é considerada uma prioridade. No entanto, a falta de acesso a cuidados de saúde primários em países em desenvolvimento, o aumento da incidência de doenças crónicas em países desenvolvidos e o aparecimento de estirpes multirresistentes têm causado sérios obstáculos à sua erradicação. As micobactérias possuem uma parede celular distinta que lhes confere muitas das suas características patogénicas e que é bastante rica em componentes lipídicos. Entre as moléculas singulares sintetizadas por micobactérias encontram-se dois polissacáridos polimetilados (PMPSs) intracelulares cuja hipotética interacção com a sintetase de ácidos gordos I (FAS-I) modula a síntese de ácidos gordos. Os PMPSs dividem-se em polissacáridos de 3-O-metilmanose (MMPs) ou lipopolissacáridos de 6-O-metilglucose (MGLPs). Embora a sua descoberta remonte à década de 1960, apenas recentemente, com o descodificar do genoma micobacteriano, foi possível compreender melhor a sua biogénese. Os MGLPs foram alvo de particular atenção por terem sido os únicos PMPS detectados em micobactérias de crescimento lento, geralmente associadas a maior patogenicidade, como M. tuberculosis. Os MMPs parecem ser exclusivos de micobactérias de crescimento rápido. Alguns do genes envolvidos na via biossintética do MGLP estão descritos como sendo essenciais para o crescimento de M. tuberculosis, tornando-os potenciais alvos terapêuticos. Recentemente foi descoberta em micobactérias uma nova via biossintética (via GlgE) que converte trealose em glicogénio através do intermediário maltose-1-fosfato. Esta via representa uma possível alternativa para a polimerização de MGLP, cuja estrutura base é semelhante à cadeia principal de glicogénio no que respeita à ligação entre glucoses. Como uma das prioridades no combate à tuberculose é a identificação de novos alvos terapêuticos, considerámos importante identificar a função e caracterizar enzimas com provável envolvimento na via do MGLP e que estivessem simultaneamente descritas como essenciais para o crescimento de M. tuberculosis. Por reunirem estas condições, o gene Rv0127, responsável pela síntese de maltose-1-fosfato, e o gene Rv2418c, localizado num operão que contém a enzima glucosil-3-fosfoglicerato fosfatase, responsável pela produção do substrato inicial para o MGLP, foram os alvos selecionados para este trabalho.O trabalho aqui apresentado contribui para elucidar a estrutura da maltocinase e para a caracterização funcional de uma nova e atípica octanoiltransferase acrescentado novas prespectivas a uma via intrincada e vital da glicobiologia micobacteriana

Mycobacteria belong to an extremely diversified bacterial genus that contains both saprophytic organisms and dangerous pathogens such as Mycobacterium leprae and Mycobacterium tuberculosis, the etiological agents of leprosy and tuberculosis, respectively. Tuberculosis (TB) is one of the deadliest diseases caused by a single infectious agent and its eradication is considered a major global health priority. Nonetheless the lack of proper access to medical care in developing countries, the burden of chronic illnesses in developed countries and the emergence of multidrug-resistant strains has hindered the process towards that goal. Mycobacteria possess a distinctive lipid-rich cell envelope to which they owe much of their pathogenicity. Among the unique molecules synthesized by mycobacteria there are two intracellular polymethylated polysaccharides (PMPSs) that likely assume a helical conformation in the cytoplasm and are postulated to interact with fatty acid synthase I (FAS-I) to modulate fatty acid synthesis. PMPSs can be polysaccharides of 3-O-methylmannose (MMPs) or lipopolysaccharides of 6-O-methylglucose (MGLPs). These molecules were discovered in the 1960’s but only recently with the unveiling of the mycobacterial genome was it possible to uncover more aspects of their biogenesis. MGLPs in particular have been the target of renewed attention because they probably represent the only type of PMPSs present in the slowly-growing phenotype frequently associated with pathogenic mycobacteria such as M. tuberculosis, while the distribution of MMP appears to be almost exclusively restricted to rapidly-growing mycobacteria. In addition, some genes involved in the MGLP biosynthetic pathway have been considered essential for M. tuberculosis growth, making their products potential drug targets. Recently a novel metabolic pathway (GlgE pathway) has been uncovered, connecting trehalose and glycogen through the intermediate metabolite maltose-1-phosphate. This pathway may also represent an alternative route for polymerization of the seemingly vital mycobacterial MGLP that has a glycogen-like arrangement of glucose units in the main chain. We pursued the identification and characterization of enzymes with probable involvement in the MGLP pathway and simultaneously proposed to be essential for M. tuberculosis growth. As a consequence of functional and genomic context surveys two genes were selected for study. Gene Rv0127 encoding a maltokinase for the synthesis of maltose-1-phosphate and Rv2418c of unknown function, but located in an operon containing the atypical glucosyl-3- phosphoglycerate phosphatase responsible for the production of the MGLP primer, glucosylglycerate. The work presented in this thesis contributes for the elucidation of the maltokinase structure and the functional characterization of a novel sugar octanoyltransferase adding new insights into an intricate and vital pathway of mycobacterial glycobiology.