A radioterapia metabólica no tratamento do adenocarcinoma pacriático

Abstract

O adenocarcinoma ductal pancreático constitui cerca de 90% de todos os tumores do pâncreas. Aquando do diagnóstico o tumor já está localmente avançado ou mestastizado, sendo resistente à quimioterapia, radioterapia e cirurgia. Neste trabalho propusemo-nos investigar se a radioterapia dirigida a recetores de peptídeos, quando associada à quimioterapia, pode representar uma forma alternativa e sinérgica de tratamento. Para esse fim, selecionámos duas linhas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático, a MIA PaCa-2 e a PANC-1 com diferenciação neuroendócrina e recetores de somatostatina. Para a sua caracterização fenotípica utilizámos imunohistoquímica e citometria de fluxo. Para a caracterização fenotípica por imunohistoquímica utilizámos marcadores epiteliais, mesenquimais, neuroendócrinos e recetores hormonais, como o anticorpo para o recetor da somatostatina 2. Para a caracterização fenotípica por citometria de fluxo na identificação de células estaminais, selecionámos os marcadores CD24, CD44 CD326/ESA e CD133. Para o perfil genético pesquisámos, por PCR e sequenciação, mutações nos genes KRAS, CDKN2A/p16INK4A, TP53 e SMAD4/DPC4 e, por eletroforese capilar estudámos instabilidade de microssatélites. Efetuámos estudos de captação com três análogos da somatostatina radiomarcados, o 99mTc-TPC, o 68Ga-DOTA-NOC, e o 177Lu-DOTA-TATE e, por citometria de fluxo, estudámos, nas linhas celulares, a expressão dos recetores da somatostatina, SSTR1, SSTR2a, SSTR2b, SSTR3, SSTR4 e SSTR5. Procedemos a ensaios de quimioterapia, com os citostáticos gemcitabina, 5-FU, docetaxel, everolimus e sunitinib, que compreenderam estudos da atividade metabólica por MTT, de viabilidade e morte celulares com anexina V/iodeto de propídio, do ciclo celular com iodeto de propídio/RNase, e do perfil imunohistoquímico após quimioterapia. Analisámos, por citometria de fluxo, o efeito da incubação das linhas celulares com a concentração do IC50 das 72 h dos citostáticos selecionados, na expressão dos recetores da somatostatina. Seguiram-se estudos de captação do 177Lu-DOTA-TATE após prévia incubação das linhas com a concentração do IC50 das 24 h. Constituímos, em ratinhos Balb/c atímicos, xenotransplantes heterotópicos das linhas celulares e, nos tumores resultantes, estudámos o perfil imunohistoquímico. A linha celular MIA PaCA-2 evidenciou a presença de dois tipos morfológicos de células, células grandes e células pequenas, e a linha PANC-1 três tipos, células grandes, células estreladas, e células pequenas. Este padrão manteve-se após tratamento com citostáticos e nos xenotransplantes. Nas linhas, após quimioterapia, e in vivo, nos xenotransplantes, ocorreram alterações isoladas do perfil imunohistoquímico observado inicialmente nas linhas sem exposição a citostáticos, com expressão ou ausência de expressão de alguns marcadores e recetores mas, para além da perda da E-caderina na linha MIA PaCA-2 e da expressão de sinaptofisina na linha PANC-1, após quimioterapia, não se observou um padrão específico e regular de alterações. As duas linhas expressam um fenótipo epitelial-mesenquimal, que se mantém após quimioterapia, e nos xenotransplantes, mas este fenótipo, por ausência da E-caderina, é mais agressivo na linha PANC-1. A linha MIA PaCA-1 evidenciou um fenótipo CD24-CD44+/++CD326-/+ e CD133/1- e a linha PANC-1 CD24-/+CD44+CD326-/+ e CD133/1-. A linha celular MIA PaCa-2 apresentou uma mutação missense, sem heterozigotia, no codão 12 do KRAS (p.G12C; GGT>TGT), uma mutação missense, sem heterozigotia, no exão 7 do TP53 (p.R248W) (CGG>TGG). A linha PANC-1 apresentou uma mutação missense, em heterozigotia, no codão 12 do KRAS (p.G12D; GGT>GAT) e duas variações missense em dois exões distintos do TP53, uma no exão 4 (p.P72R; CCC>CGC), que corresponde a um polimorfismo comum, e outra no exão 8 (p.R273H; CGT>CAT). A amplificação dos exões 1-3 do gene CDKN2A/p16INK4A identificou uma delecção em homozigotia, incluindo os três exões, em ambas as linhas. As duas linhas expressaram todos os recetores da somatostatina, com SSTR3, SSTR1 e SSTR2b predominando na linha MIA PACa-2, e SSTR2a e SSTR5 predominando na linha PANC-1. Os estudos de captação com 99mTc-TOC, 68Ga-DOTA-NOC e 177Lu-DOTA-TATE evidenciaram uma superior captação do 68Ga-DOTA-NOC em ambas as linhas celulares. Os estudos demonstraram que todos os citostáticos conseguiram inibir a atividade metabólica das linhas MIA PaCA-2 e PANC-1, com o docetaxel, e depois o sunitinib, revelando maior eficácia. Os estudos de viabilidade e morte evidenciaram que o sunitinib e o docetaxel foram os mais eficazes na indução de morte na linha MIA PaCa-2, e o sunitinib e a gemcitabina na linha PANC-1. A morte celular decorreu essencialmente por apoptose, com exceção do sunitinib, em que decorreu por apoptose/necrose. Os estudos de ciclo celular mostraram que, nas duas linhas, a sua paragem se deu essencialmente na fase G0/G1. Na linha PANC-1, para além da paragem em G0/G1, ocorreram paragens na fase S, com o 5-FU, e na fase G2/M, com o docetaxel. Após modulação celular com os citostáticos, ocorreu, nas duas linhas, de uma forma geral, aumento da expressão dos recetores. Este aumento foi mais pronunciado na linha PANC-1. Os estudos de captação do 177Lu-DOTA-TATE após modulação celular com as concentrações do IC50 dos citostáticos às 24 h demonstraram, na linha MIA PaCa-2 um aumento da captação relativamente ao controlo com todos os citostáticos, com exceção do 5-FU. Na linha PANC-1 só ocorreu aumento da captação com o sunitinib. Os resultados obtidos in vitro apoiam a hipótese de que a associação da quimioterapia, particularmente do sunitinib, à radioterapia dirigida a recetores de peptídeos, particularmente com o 177Lu-DOTA-TATE, tem efeito sinérgico, e pode representar uma opção na terapêutica do adenocarcinoma ductal pancreático.

The pancreatic ductal adenocarcinoma represents about 90% of all the tumors of the pancreas. When the tumor is diagnosed it is already locally advanced or metastasized, being resistant to chemotherapy, radiotherapy and surgery. In this Thesis, we intend to investigate whether the radiation aimed at peptide receptors when combined with chemotherapy, can represent an alternative and synergistic way of treatment. Therefore, we have selected two cell lines of pancreatic ductal adenocarcinoma, MIA PaCa-2 and PANC-1, with neuroendocrine differentiation and somatostatin receptors. For their phenotypic characterization we used immunohistochemistry and flow cytometry. For the phenotypic characterization through immunohistochemistry we used epithelial markers, mesenchymal, neuroendocrine and hormone receptors, such as the antibody to the somatostatin 2 receptor. For the phenotypic characterization through flow cytometry in the identification of stem cells, we selected CD24, CD44 CD326/ESA and CD133 markers. For the genetic profile, we researched by PCR and sequencing mutations in the KRAS, CDKN2A/p16INK4A, TP53 and SMAD4/DPC4 and, through capillary electrophoresis we analyzed the microsatellite instability. We have performed uptake studies with three radiolabeled somatostatin analogues, 99mTc-TPC, 68Ga-DOTA-NOC, and 177Lu-DOTA-TATE and, through flow cytometry, we studied, in cell lines, the expression of the somatostatin receptors, SSTR1, SSTR2a, SSTR2b, SSTR3, SSTR4 and SSTR5. We performed chemotherapy trials, with the cytostatics gemcitabine, 5-FU, docetaxel, everolimus and sunitinib, which comprised studies of metabolic activity by MTT, of cell viability and death with annexin V/propidium iodide, of the cell cycle with propidium iodide/RNase, and the immunohistochemical profile after chemotherapy. We analyzed by flow cytometry the effect of the incubation of the cell lines with 72 h IC50 concentration of the selected chemotherapeutic agents, in the expression of the somatostatin receptors. This was followed by uptake studies of 177Lu-DOTA-TATE after previous incubation of the cell lines with 24 h IC50 concentration. We established in athymic Balb/c mice, heterotopic xenografts of the cell lines and, in the resulting tumors, we analyzed the immunohistochemical profile. MIA PaCA-2 cell line evidenced the presence of two morphological types of cells: large cells and small cells, while PANC-1 cell line evidenced the presence of three types: large cells, stellate cells, and small cells. This pattern was maintained after treatment with cytostatic and in xenografts. In the lines after chemotherapy, and in vivo in xenografts, there were isolated changes of the immunohistochemical profile observed initially in the cell lines without exposure to cytostatic, with expression or absence of expression of some markers and receptors but, in addition to the E- cadherin loss in MIA PaCA-2 cell line and synaptophysin expression in PANC-1 line after chemotherapy, there was no specific and regular pattern of changes. Both lines express an epithelial-mesenchymal phenotype, which remains after chemotherapy, and in the xenografts, but this phenotype, due to lack of E-cadherin, is more aggressive in PANC-1 cell line. MIA PaCA-1 cell line has evidenced a phenotype CD24-CD44+/++CD326-/+ and CD133/1- and PANC-1 cell line evidenced a phenotype CD24-/+CD44+CD326-/+ and CD133/1-. MIA PaCa-2 cell line presented a missense mutation, without heterozygosity at codon 12 of the KRAS (p.G12C; GGT>TGT) and a missense mutation, with no heterozygosity at exon 7 of the TP53 (p.R248W) (CGG>TGG). PANC-1 cell line presented a missense mutation, with heterozygosity, at codon 12 of the KRAS (p.G12D; GGT>GAT) and two missense variations in two different exons of the TP53, one in the exon 4 (p.P72R; CCC>CGC), which corresponds to a common polymorphism, and another in the exon 8 (p.R273H; CGT>CAT). The amplification of the exons 1-3 of the gene CDKN2A/p16INK4A identifyed a deletion in homozygosity, including the three exons in both lines. Both lines expressed all the somatostatin receptors, with SSTR3, SSTR1 and SSTR2b predominating in MIA PACa-2 line, and SSTR2a and SSTR5 predominating in PANC-1 line. The uptake studies with 99mTc-TOC, 68Ga-DOTA-NOC and 177Lu-DOTA-TATE evidenced a higher uptake of the 68Ga-DOTA-NOC in both cell lines. Studies have shown that all cytostatic were able to inhibit the metabolic activity of MIA PaCA-2 and PANC-1 cell lines, with docetaxel, and after the sunitinib, showing greater effectiveness. The viability and death studies have shown that sunitinib and docetaxel were the most effective in inducing death in MIA PaCa-2 line, and the sunitinib and the gemcitabine in PANC-1 line. Cell death occurred primarily through apoptosis, with the exception of sunitinib, in which it happened by apoptosis/necrosis. The cell cycle studies show that in both lines its stop occurred essentially in phase G0/G1. In PANC-1 line, besides the stop in G0/G1, there were other stops in phase S, with 5-FU, and in phase G2/M, with docetaxel. After cell modulating with the cytostatics, there was a general increase of the receptors expression in both lines. This increase was more pronounced in PANC-1 line. The uptake studies of 177Lu-DOTA-TATE, after cell modulating with 24 h IC50 concentration of the cytostatics have shown, in MIA PaCa-2 line, an increase of the uptake regarding the control with all the cytostatics, except for the 5-FU. In PANC-1 line there was only an increase of the uptake with the sunitinib. The in vitro results support the hypothesis that the combination of chemotherapy, particularly of sunitinib, with radiation aimed at peptide receptors, particularly with the 177Lu-DOTA-TATE, has a synergistic effect, and may represent an option in the treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma.