Potencial terapêutico de inibidores do NF-KB no linfoma difuso de grandes células B

Abstract

O Linfoma Difuso de Grandes Células B é o mais comum dos subtipos de Linfoma não-Hodgkin, representando cerca de 30 a 58 % dos casos destas neoplasias. Tal como em outros linfomas, a via do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) está envolvida no seu processo oncogénico. Após ativação, o NF-kB é translocado do citoplasma para o núcleo celular, acionando a transcrição génica de fatores antiapoptóticos. Desta forma, a desregulação da via do NF-kB confere às células cancerígenas vantagem na sobrevivência por inibir a apoptose, sendo responsável pelo desenvolvimento de vários Linfomas não-Hodgkin e sendo essencial para o Linfoma Difuso de Grandes Células B. A inativação do NF-kB conseguida pela inibição da IKK ou pela inibição da degradação proteasómica do IkB surge assim como potencial estratégia terapêutica neste tipo de linfomas. O objetivo desta investigação foi avaliar o potencial terapêutico de um inibidor da IKK (Parthenolide) e de um inibidor do proteasoma (MG-262) no Linfoma Difuso de Grandes Células B, em monoterapia e em associação com a quimioterapia convencional. Pretendeu-se ainda clarificar os mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade induzida por estes fármacos. Uma linha celular de Linfoma Difuso de Grandes Células B, as células Farage, foi testada na ausência e na presença de doses crescentes de Parthenolide e MG-262, em monoterapia e em associação com a Vincristina, fármaco anticancerígeno do esquema de tratamento convencional. O efeito antiproliferativo foi avaliado pelo Teste metabólico da resazurina. O tipo de morte celular foi investigado por Citometria de Fluxo (pela dupla marcação celular com Anexina V e Iodeto de Propídeo e pela análise do ciclo celular) e por Microscopia Ótica (usando a coloração May-Grünwald-Giemsa). A expressão da Caspase 3, molécula reguladora da apoptose, foi analisada por Citometria de Fluxo utilizando um anticorpo monoclonal marcado com um fluorocromo. Este método foi utilizado para avaliar a expressão do NF-kB fosforilado e de conjugados de ubiquitina, de forma a esclarecer o efeito farmacodinâmico do Parthenolide e do MG-262, respetivamente. Os resultados obtidos mostram que o Parthenolide e o MG-262, tanto em monoterapia como em combinação com a Vincristina, reduziram a viabilidade celular de modo dependente da dose e do tempo de exposição, induzindo morte celular predominantemente por apoptose. Um efeito antiproliferativo sinérgico foi observado quando a Vincristina foi usada em combinação com o MG-262, sugerindo um benefício clínico. A diminuição do NF-kB fosforilado e o aumento dos conjugados de ubiquitina traduzem a inibição da IKK e do proteasoma, respetivamente pelo Parthenolide e MG-262, confirmando o efeito inibitório da via do NF-kB por estes dois fármacos. Assim, este estudo sugere que o Parthenolide e o MG-262 podem constituir novas abordagens terapêuticas no Linfoma Difuso de Grandes Células B.

Diffuse Large B-cell Lymphoma is the most common type of non-Hodgkin lymphoma, accounting for about 30 to 58% of all cases. As in other lymphomas, the nuclear transcription factor kB (NF-kB) pathway is involved in the oncogenic process. After activation, NF-kB translocates from the cell cytoplasm to the nucleus where it participates in gene transcription, resulting in the expression of antiapoptotic factors. Therefore, the deregulation of NF-kB pathway plays a role in the development of several non-Hodgkin lymphomas as it confers cancer cells a survival advantage by inhibiting apoptosis, being critical in Diffuse Large B-cell Lymphoma. The inactivation of NF-kB by inhibiting IKK or the degradation of IkB in the proteasome might be a new therapeutic strategy in this kind of lymphomas. The aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of an IKK inhibitor (Parthenolide) and a proteasome inhibitor (MG-262) in Diffuse Large B-cell Lymphoma, both in monotherapy and in association with conventional chemotherapeutic drugs. We also intended to clarify the molecular mechanisms involved in the cytotoxicity induced by these drugs. We used the Farage cells, a Diffuse Large B-cell Lymphoma cell line, tested in absence and presence of increasing concentrations of Parthenolide and MG-262, both in monotherapy and in association with Vincristine, an anticarginogenic drug used in the conventional therapeutic regimen. The antiproliferative effect was assessed by the resazurin metabolism assay. The type of cell death was investigated by flow cytometry (with Annexin V and Propidium Iodide double staining and cell cycle analysis) and optical microscopy (using May-Grünwald-Giemsa staining). The expression of the apoptosis-regulating molecule Caspase 3 was assessed by flow citometry using an antibody labeled with a fluorescent probe. This same methodology was used to measure the expression of phosphorilated NF-kB and ubiquitin conjugates in order to evaluate the pharmacodynamic effect of Parthenolide and MG-262, respectively. The results obtained showed that Parthenolide and MG-262, either alone or in association with Vincristine, induced cell death mainly by apoptosis in a time- and dose-dependent manner. A synergistic antiproliferative effect was observed when Vincristine was used in combination with MG-262, suggesting a clinical benefit. The observed decrease in phosphorylated NF-kB and the increase in ubiquitin conjugates are related with IKK and proteasome inhibition, respectively by Parthenolide and MG262, which confirms the effects of these drugs on NF-kB pathway inhibition. This study suggests that Parthenolide and MG-262 might be used as a new therapeutic approach in Diffuse Large B-Cell Lymphoma.