Role of Ca2+-permeable AMPA receptors in excitotoxicity : contribution of gluR4 subunit phosphorylation and characterization of the OGD-induced cell death

Abstract

Ca2+-permeable α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) receptors have been reported to be crucial for glutamate-induced neuronal death in some acute and chronic neurodegenerative diseases. Indeed, the selective death of CA1 hippocampal neurons after transient global ischemia is related to molecular changes in the composition of AMPARs, which render them Ca2+-permeable. However, the excitotoxic mechanisms associated with Ca2+-permeable AMPARs are not completely understood and therefore further studies are required to identify the downstream signaling pathways activated under ischemic stimulation. A thoroughly knowledge of such pathways can be of outstanding relevance to the development of therapeutic strategies that target protein interactions mediated by ischemic insults, while sparing the physiological activity of AMPA receptors. Recently, the AMPA receptor subunit GluR4 was shown to be a possible physiological JNK substrate (Thomas et al., 2008). Our previous results in HEK-GluR4 cells, which constitutively express GluR4-containing Ca2+-permeable AMPARs, showed that excitotoxicity increased the GluR4 phosphorylation on T855 (Vieira, M., unpublished data), the residue described as specifically phoshorylated by JNK. Thus, to investigate the role of JNK in the phosphorylation of GluR4-T855, we stimulated HEK-GluR4 cells in the presence of the JNK pathway inhibitors CEP11004 and SP600125, which caused a decrease in the GluR4-T855 phosphorylation levels, therefore indicating the involvement of a kinase of the JNK pathway in this event. To evaluate the role of GluR4-T855 phosphorylation to the excitotoxic response mediated by those receptors, HEK293-A cells were transduced with wild type GluR4 or with the GluR4 mutants GluR4-T855A and GluR4-T855D and then submitted to excitotoxic stimulation. The evaluation of cell viability did not 2 indicate a function of phosphorylated GluR4-T855 on GluR4-containing Ca2+- permeable AMPAR-mediated excitotoxicity. On the other hand, to pursue our aim of identifying the molecular mechanisms coupling Ca2+-permeable AMPARs to excitotoxic pathways, we challenged cultures of hippocampal neurons with OGD, an in vitro model of brain ischemia that induces synaptic targeting of Ca2+-permeable AMPARs (Liu et al., 2006). We evaluated the effect of 1-3 hours OGD stimuli in the hippocampal neuron viability. Mature (14-15 DIV) hippocampal cultures displayed a decrease in the metabolic activity, assessed by the MTT test, which correlated with the time-length of the OGD stimuli. In order to characterize the contribution of the different ionotropic glutamate receptors to the reduction in neuronal viability, we used the selective NMDA receptor antagonist MK- 801 and the AMPA/KA receptor antagonist NBQX. In hippocampal neuron cultures with 8 DIV, analysis of the nuclear morphology indicates that both MK801 and NBQX prevented the OGD-induced cell death, pointing for a contribution of NMDA and AMPA/KA receptors to the excitotoxic response. However, in mature cultures with 14- 15 DIV, only NBQX prevented changes in the nuclear morphology, showing that in these cultures the AMPA/KA receptors are the main ionotropic glutamate receptors responsible for the OGD-induced excitotoxicity. We also observed a decrease in the levels of GluR2 in hippocampal slices submitted to mild OGD, by performing biotinylation of plasma membrane-associated proteins, suggesting that OGD induces changes in surface membrane AMPAR trafficking similar to those described for cultured hippocampal neurons. Taken together, these results suggest that developmental changes in the composition of ionotropic glutamate receptors, or in the machinery associated to the glutamatergic neurotransmission, regulates the OGD-induced excitotoxic response of hippocampal neurons. Moreover, our results support the OGDchallenge in hippocampal neurons as an ischemic model suitable for the in vitro study of excitotoxic mechanisms coupled to GluR2-lacking Ca2+-permeable AMPARs. Additionally, our results support the recent observation that GluR4-T855 is a new substrate of JNK. However, this phosphorylation event does not influence the GluR4- containing Ca2+-permeable AMPAR-mediated excitotoxicity.

Os receptores AMPA permeáveis a Ca2+ têm revelado ter um papel crucial na morte de neurónios induzida pela libertação excessiva de glutamato em algumas doenças neurodegenerativas graves. De facto, estes receptores têm sido relacionados com a morte selectiva dos neurónios da zona CA1 do hipocampo após isquémia global, durante a qual ocorrem alterações moleculares na composição destes receptores, tornando-os permeáveis a Ca2+. No entanto, os mecanismos moleculares que relacionam estes receptores com a activação de vias de sinalização excitotóxicas não são ainda totalmente conhecidos, pelo que são necessários mais estudos com vista à identificação das vias de sinalização activadas em situação de isquémia. A compreensão dessas vias pode ser de elevada importância para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas à disrupção selectiva de interacções proteicas mediadas por insultos isquémicos, sem, no entanto, interferir com a actividade fisiológica destes receptores. Recentemente, mostrou-se que a subunidade GluR4 dos receptores AMPA pode constituir um substrato da cinase JNK em condições fisiológicas (Thomas e tal., 2008). Resultados prévios obtidos em células HEK293-GluR4 (expressando constitutivamente receptores AMPA permeáveis a Ca2+ contendo GluR4) mostraram que a excitotoxicidade aumenta a fosforilação do resíduo T855 do GluR4 (Vieira, M., resultados não publicados), resíduo especificamente fosforilado pela JNK. Assim, para confirmar a fosforilação do resíduo T855 pela JNK em condições de excitotoxicidade, células HEK-GluR4 foram submetidas a estimulação excitotóxica na presença de inibidores farmacológicos da JNK, CEP11004 e SP600125. Verificou-se a diminuição nos níveis de fosforilação do mesmo resíduo, o que revela a participação de uma cinase da via de sinalização da JNK neste processo. Para compreender a contribuição da fosforilação do GluR4 para a morte celular mediada por estes receptores, célulasHEK293-A foram transfectadas com GluR4 normal ou com mutantes desta subunidade, GluR4-T855A e GluR4-T855D, sendo posteriormente submetidas a estimulação excitotóxica. A viabilidade celular observada nestas células não confirma uma função da fosforilação do GluR4 para o mecanismo de morte celular desencadeado após a sobreactivação de receptores AMPA permeáveis a Ca2+. Por outro lado, no sentido de procurar identificar os mecanismos moleculares que relacionam os receptores AMPA permeáveis a Ca2+ com vias de excitotoxicidade, culturas primárias de neurónios do hipocampo foram submetidas a OGD, um modelo in vitro para a isquémia cerebral que induz o endereçamento destes receptores para a sinapse (Liu et al., 2006). A viabilidade das culturas de hipocampo foi avaliada após 1h- 3h de estímulo de OGD. As culturas maturas (14-15 DIV) submetidas a OGD apresentaram uma redução na actividade metabólica, avaliada pelo teste do MTT, correlacionada com a duração do tempo do estímulo de OGD. Além disso, para caracterizar a contribuição dos diferentes receptores ionotrópicos do glutamato para a redução da viabilidade celular, usaram-se os antagonistas MK-801 e NBQX, selectivos para receptores NMDA e AMPA/KA, respectivamente. Nas culturas de neurónios do hipocampo com 8 DIV, a análise da morfologia nuclear indicou que ambos os antagonistas impediram a morte celular induzida por OGD, apontando uma contribuição dos receptores NMDA e AMPA/KA para a resposta excitotóxica. Contudo, em culturas maturas com 14-15 DIV, apenas o antagonista NBQX evitou as alterações na morfologia nuclear dos neurónios, demonstrando que, nestas culturas, os receptores AMPA/KA poderão ser o tipo predominante de receptores ionotrópicos do glutamato para a excitoxicidade induzida por OGD. Por fim, observou-se, através da biotinilação de proteínas associadas à membrana plasmática, que em fatias de hipocampo submetidas a um estímulo breve de OGD, os níveis da subunidade GluR2 à superfíciedas células são reduzidos, o que sugere um efeito do estímulo de OGD no endereçamento destes receptores para a membrana plasmática dos neurónios do hipocampo, semelhante ao observado já em culturas do hipocampo. De uma forma geral, os resultados obtidos sugerem que modificações na composição de receptores ionotrópicos ao longo do desenvolvimento dos neurónios, ou na maquinaria associada aos processos de neurotransmissão do glutamato, influenciam a resposta excitotóxica mediada por OGD em neurónios do hipocampo. Além disso, estes resultados apoiam o estímulo de OGD como modelo in vitro para a isquémia apropriado para estudos de sinalização de excitotoxicidade mediada por receptores AMPA permeáveis a Ca2+.